摘要目的:注射Kainate诱导的大鼠边缘叶发作模型.检测caspase-12大鼠海马神经元表达。方法：立体定位海马注射Kainate诱导诱导激活海马内的KAI受体后，以持续记录脑电、局部脑血流（rgional cerebral blood flav，rCBF),用TUNEL染色和ciesyl violet染色观察海马神经元存活和凋亡；用免疫荧光和Western blot检测海马caspast-12的表达。结果：4h时caspase-12出现裂解片段，8h时出现TUNEL阳性细胞，24h时达高峰。脑室内注射caspase-12抑制剂zrLEHrHluoKmettylketoneCzrLEHDfmk)可减少TUNEL阳性细胞，增加存活神经元；后在KA注射同侧海马的CA3区神经元caspasd免疫反应性增强；对侧海马未见TUNEL阳性细胞及caspase-12的上述变化。发作前后rCBF无明显变化。结论：Kainate可诱导KAI的激活。caspase-12可能是KAI的靶点，也可能是神经元损伤的潜在靶点。
关键词 Kainate；海马；caspase-12
aspase-12属于Caspase第一家族（又称白细胞介素1-β转换酶家族），主要存在于细胞内质网中，在全身多种器官组织细胞中均有表达[1]。Caspase-12主要由三大部分组成：前区域，大亚基和小亚基。在此三部分之间又存在着几个不同区域，例如Caspase区域和Caplain区域等。Caspase-12前体（proCaspase）通过不同激活途径切割不同区域被激活，可引起Caspase其它家族成员，如Caspase-3,9活化，通过诱导激活下游死亡因子，如Lamin、Rb、PARP等，最终导致细胞凋亡[2-3]。caspase-12是细胞凋亡线粒体通路的重要启动酶，在线粒体凋亡通路中，KAI一旦释放即与细胞凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease activating factolr1 Apaf-1 )结合，在 dATP/ATP存在条件下活化caspase-12，caspase-12再激活下游效应。caspase(caspase-3、caspase~6或caspase-7)，诱导细胞凋亡。以往研究发现caspase12的细胞内线粒体途径参与了缺血性脑损伤和癫痫致脑损伤的凋亡[4]。但caspase-12介导的发作致脑损 伤是否与脑缺血有关尚未见报道，我们检测了发作前后大鼠局部脑血流（regional cerebral blood flow，rCBF) 的变化，观察发作诱导的神经元凋亡与脑血流的关系，分析caspase-12可能机制。
1.材料与方法
模型的建立，建立单侧杏仁核内注射KA诱导的大鼠边缘模型。取SD雄性大鼠60只（长沙医学院基础医学院提供）体重250~320g。水合氯醛0.3g/kg-1腹腔注射后，2%利多卡因双侧外耳道表面麻醉;将大鼠背位固定于立体定位仪上，股静脉插管备用地西泮。根据Paxions watrson图谱确定杏仁核给药部位，AP：—2.8mm,RL：—4mm,H：8mm。以微量注射注入Kainate (0.5g溶于0.5PBS缓冲液中，pH值调至7.4)，6只大鼠脑室内注射caspase-12抑制剂zrLEHD-fmk(0.8%，于Kainate注射前20、5min及KA注射后1、12h分4次给药）rCBF采用LDF100CCBioPACsystemsMP150连续监测，监测部位在(AP=—4mm,L=4mm)处的硬脑膜表面，相当于Kainate注射部位同侧颞叶，记录Kainate注射前10min的r~CBF为基线，注射后每隔10min记录一次，脑灌注率以占相应基线的百分率的均值表示。术中采用电热毯保温，保持大鼠肛温37~37.5°C。
1.1动物分组
正常对照组（6只）：杏仁核注射PBS(36只）：杏仁核内注射Kainate(0.5ml作溶于PBS0.5ML缓冲液中，pH值调至7.4)，1h后经股静脉注射地西泮30mg/kg—1，根据处死大鼠的时间点分0、2、4、8、24、72h6组，每组6只；试验给药组（6只）z-LEHD-fmk(脑室）+Kainate(杏仁核内）实验对照组(6只）:PBS(脑室）+Kainate(杏仁核内）空白对照组（只）:PBS(脑室)+PBS(杏仁核内）;均于地西泮注射终止发作后24h处死，共计60只。
1.2组织切片 以10%水合氯醛麻醉大鼠，4%多聚 甲醛进行心脏灌注固定脑组织，待取出脑组织后再在上述固定液中固定3h,然后置入20%蔗糖磷酸缓冲液中，4°C浸泡，待脑组织下沉后取出，于预冷的丙酮(一80C)内速冻。用冰冻切片机(德国，Leica)连续冠状切片，70C保存。
TUNEL和cresy violet染色 TUNEL试剂盒（德国Oncogene公司）按试剂盒说明书进行染色与检测。Cresy violet染色按常规尼氏染色操作。光镜下选择CA3区比较观察每个视野中棕黄色TUNEL阳性细胞和cresyl violet染色的存活细胞，并记数连续3张脑切片整个CA3区TUNEL阳性细胞，取其平均数。
神经细胞双重免疫荧光1%Triton破膜20minPBS洗片3次，10%小牛血清室温封闭1h。神经元用1000小鼠抗NeuN单克隆抗体，4C孵育过夜。PBS洗3次，然后用1:1000的绵羊抗小鼠IgG-Cy3(红色)室温孵育2h。PBS洗3次，加1:200的兔多克隆抗体(SantaCruz公司）4°C过夜。PBS洗3次，然后用1:1000的绵羊抗兔-IgS-FITC(绿色）室温孵育2h。PBS洗3次，甘油封片荧光显微镜观察。用正常兔血清代替作为实验方法的空白对照。
caspase-12的Western blot测定①海马脑组织蛋白的制备取100mg大鼠海马组织加300mL单去污剂蛋白质裂解缓冲液（1mmolL,pH8.0,150mmol。L—1NaCl，100"g。mL—1PMSF,1"g-mL—1Aprotinin,1%TritonX-100)，15000r/min*4C离心30min,取上清液，即为细胞总蛋白质。②蛋白质印迹分析:步骤为制备15%SDS-聚丙烯凝胶，加样蛋白电泳分离，电转移至PVDF膜。
印迹膜封闭1h后，分别加入5%奶粉TBS稀释的兔抗caspase12(1：200)4°C过夜，TBS洗膜3次，后加1:200的生物素羊抗兔抗体孵育2h,TBS洗膜3次，AB液孵育1h(：100)TBS洗膜3次，DAB显色，实验重复3次。
2.统计学处理 全部数据用平均数士标准差处理，采用SPSS22.0软件行单因素方差分析和各组均数的最小显者差值法(LSD法)检验。
3.结果
大鼠rCBF的变化 单纯组脑灌注率在Kainate注射后10~20min内显示轻微升高趋势，没有超过基线的10%,随后于20~60min内逐渐下降，下降幅度未超过基线的8%
杏仁核注射Kainate同侧海马CA3区TUNEL阳性细 胞和存活神经元的变化及z-LEHDfmk的影响终止发作，24 h后Kainate注射同侧海马CA3区KAI受体达高峰，对侧海马未检测到KAI受体，对照 组海马CA3区及各实验组双侧海马CA1区KAI受体均未见明 显变化。Kainate注射同侧海马CA3区存活神经元在终止，24 h后明显减少。z-LEHD-fmk组海马CA3区的 KAI受体比发作组明显减少，存活神经元增加脑室内注射Kainate减少同侧海马CA3区aspase-12未发现，但8h出现aspase-12，24h达高峰，72h较24h减少。应用z-LEHD-fmk后发作组海马CA3区TUNELaspase-12减少，存活神经元增加。KA诱导发作后同侧海马CA3区caspase-12的变化免疫组化显示。caspase-12在脑神经元内构成性表达，分布于神经元细胞核周围，发作终止24h时同侧海马CA3区caspase-12免疫反应性增强。同侧海马CA3区caspase-12的表达后4h出现裂解片段，并持续存在到72h。
4.讨论
在线粒体调亡通路中，cytC与Apaf-1和caspase-12结合形成凋亡蛋白体激活caspaseA进而活化下游导致细胞凋亡。完整的caspase-12为46000多肽.激活后裂解为37000的活性片段。本研究显示：Westernblot检测到杏仁核注射Kainate后同侧海马caspase-12活性裂解片段.持续72h,下游底物在4h出现活性裂解片段[5]。caspase-12在脑内神经元表达呈细胞核周围分布，KAI诱导后caspase12免疫反应性增强。8hKainate注射同侧海马CA3区出现神经元凋亡增多，24h达高峰，72h减少，72h神经元凋亡数目减少的原因可能与部分KAI受体的DNA链自行修复和部分凋亡细胞已发生溶解或被吞噬等因素有关，Kainate注射对侧未见caspase12[6-7]。给予caspase12抑制剂z-LEHD-fml.明显增加海马CA3区的存活神经元.减少凋亡神经元。提示KAI受体介导了caspase12神经元凋亡机制并可能是癫痫神经元损伤的潜在性治疗靶点。
最近研究表明[8-10]caspase-12介导的细胞内线粒体途径参与了缺血性脑损伤和癫痫发作致脑损伤的凋亡。但由caspase-12介导的癫痫发作致脑损伤是否与脑缺血有关尚未见报道。本试验组监测了海马的caspase-12.未见脑血流的明显变化.提示caspase12介导的发作大鼠同侧海马CA3区神经元凋亡可能是II性放电的结果.与脑缺血无关[11]。我们认为:①caspase-12的激活参与神经元的异常放电诱导的神经元损伤.且与脑缺血无关;②caspase-12可能是神经元损伤的潜在靶点。
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