【摘要】：通过分离得到4株耐铅菌均能在Pb2+浓度范围为100-1000 mg/L的培养液中生长。以硝酸铅配制Pb2+标准液，发现蚕豆根尖MCN与Pb2+的浓度在100~400 mg/L，pH 6, 25℃等条件下呈明显线性关系（R=0.991），而当高于400 mg/L时线性关系不明显；分离得到的根瘤菌在Pb2+浓度为 100~400 mg/L时, 去除率均高于95%；Pb2+浓度为 800 mg/L时去除率低于45%，Pb2+浓度为 900 mg/L时，保护作用不明显。通过本实验的研究，以期对微生物修复Pb污染土壤及Pb检测提供参考。
关键词：根瘤菌；Pb；MCN
中图分类号：X172
铅是一种重金属，由铅组成的盐类大部分是不溶于水的，当水体中铅的浓度达到一定范围时就会对人体、渔业、农业灌溉等等都会产生极大的危害，铅在人体内富集可以使铅中毒。微核试验是根据被打断的DNA分子或由纺锤丝断裂造成整条染色体落后于核分裂形成微核的现象来检测某些理化因素造成遗传损伤的一种简便、快速的遗传毒理学研究方法［1］。蚕豆根尖细胞微核监测技术在水质污染监测和致突变剂检测研究中得到广泛应用，并被国家环保局认定为污水遗传毒性测定的标准方法，是一种值得推广的环境监测方法［2］。
一、材料
1.1 试验准备：蚕豆，购自种子市场; 待测液，土壤过滤液。
1.2 主要仪器：烧杯、载玻片、镊子、恒温解离箱、普通光学显微、镜等，均由盘州市第十二中学生物实验室提供。
1.3 主要试剂：卡诺液、盐酸、改良苯酚品红染液等。
2 方法
2.1 试验步骤
2.1.1 催芽 将蚕豆种子放入盛有自来水的烧杯中，置于25 ℃的恒温箱内，浸泡 20～30 h，期间换水2～3 次，用于更换的水先置于25 ℃的温箱中预热。待种子吸胀后，用纱布包裹置于解剖盘内，保持适宜的湿度，在 25 ℃ 的温箱中催芽12～24 h。待种子初生根露出2～3 mm时选取发芽良好的种子，放入铺有薄层温脱脂棉的解剖盘内，置于25 ℃的温箱中继续催芽，保持湿度。再经 36～48 h，种子大部分初生根长至2～3 cm，根毛发育良好。
2.1.2 标签 取7组培养皿(含1组对照)，分别标明各自处理条件。
2.1.3 分装 选取发育良好、根尖长短粗细一致的种子，每组 5 粒，随机分装至上述培养皿中。
2.1.4 胁迫条件 将被检测液倒入培养皿中，使被检测液浸泡根尖，暴露 24 h; 被检测液按20%、40%、
50%、60%、80%、100%体积用纯化水稀释，分别标注为浓度 1，2，3，4，5，6。
2.1.5 材料恢复
将处理的种子用纯化水浸洗 3 次，每次3 ～ 5 min，洗净后的种子放入新铺好湿脱脂棉的培养皿内，置于 25 ℃的恒温箱中，保持适度的培养条件使根尖细胞恢复 24 h。
2.2 观察步骤
2.2.1 固定 吸干恢复后种子表面的水分，从根尖切下 1 cm 长的幼根用卡诺氏固定液( 无水乙醇∶冰醋酸 = 3∶1) 固定24 h。
2.2.2 解离 从5个根尖中随机取3个固定好的用纯化水浸洗 2 次，然后用 1 mol /L 的盐酸在 60 ℃ 水
浴中解离 25 min 左右，直至根尖软化。
2.2.3 染色 用纯化水浸洗 2 次后，浸泡于改良苯酚品红染色。
2.2.4 制片 将幼根放在擦净的载玻片上，用解剖做3次平行试验，每次平行试验中均配以纯化水处理作为对照，然后在样本中培养观察微核数。针截除根冠区，截留下1 mm 左右的根尖分生区，用解剖针将根尖捣碎。
2.2.5 镜检 先将制片置于显微镜低倍镜下，找到分生组织区细胞分散均匀、膨大、分裂相较多的部位
转到高倍镜(物镜40 ×) 下进行观察，凡是在主核大小的1 /3以下，并与主核分离、着色与主核相当或稍浅的圆形、椭圆形、不规则形小核即为微核。每个根尖至少观察 1 000 个细胞，记录微核细胞、分裂相细胞数［5］。
3 结果与分析
3.1 结果观察
在显微镜下观察所做装片，其中对照组细胞未见微核产生，有丝分裂各时期特征明显，其余为试验中
效果明显的典型图二 。
3.2 数据的统计分析
为提高结果的准确性，观察时任意选取 8～12个视野，统计视野中所有细胞数及各自视野产生的微核
数，结果见表 1。
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4 结论
蚕豆根尖细胞微核监测技术不仅具有灵敏度高、可靠性强、取材简单、条件易控制、试验周期短、监测费用低等优点，还可以直接反映多种污染物对生物遗传物质的综合影响，而且反映出的遗传毒性是根据真核细胞DNA分子损伤试验得出的，这是理化监测所不能达到的，是一种值得推广的环境监测方法。通过我们的研究发现，Pb2+的污染浓度在100~400 mg/L，微核数和，Pb2+浓度呈明显线性关系，且根瘤菌根瘤菌在此浓度区间对蚕豆根尖有明显的保护作用，保护上限为900 mg/L。
参考文献：
[1]曹莹，马宁等，西北地区金属尾矿地根瘤菌的重金属抗性及其系统发育研究[J]，农业环境科学学报，2010,6(1):1156-1163.
[2]邓波,黄怀琼等重金属镉（cd）对花生结瘤和生长发育的影响[J]，微生物学杂志,1996,2(1):10-13.
[3] GRANT W F．Higher plant assays for the detection of chromosomal aberrations and gene mutations—a brief historical background on their use for screening and monitoring environmental chemicals[J]．Mutation Research．1999．426：107-112．