【摘要】 目的 筛选中药半枝莲中总黄酮的提取纯化最佳工艺。方法 采优选D101大孔树脂，对影响总黄酮纯化工艺的因素进行研究，确定总黄酮纯化的最佳工艺。结果 以 pH为2.0，总黄酮浓度为3.5 mg·ml-1的溶液做为上样液，以2 BV·h-1的流速上样，吸附完全后，以纯化水洗脱至无色，再以体积为20 BV的 60%乙醇进行洗脱。结论 优选得到的工艺稳定，方法切实可行，为规范半枝莲中总黄酮的提取纯化工艺提供了理论依据。
【关键词】 半枝莲；正交试验；大孔树脂；总黄酮
半枝莲具有清热解毒、活血祛瘀、消肿止痛、抗癌等功效。近年来，半枝莲的药用价值及其临床应用越来越受到广泛的重视，但迄今为止，国内医药市场上与半枝莲有关的制剂只有以全草或粗提物入药的半枝莲片、半枝莲胶囊等少数品种，目前从半枝莲中已经分离出了一些化合物，主要是黄酮类、生物碱、甾体以及酚类等，其中黄酮类成分为其主要活性成分[1-2]。因此研究半枝莲总黄酮提取纯化工艺具有重要意义，大孔树脂柱纯化法是黄酮类化合物最常用的纯化方法[3]，本文利用D101大孔树脂对该成本进行纯化，以半枝莲中总黄酮类含量及收率为考察指标，优化了方法。籍以为半枝莲总黄酮制剂的深度开发、完善产品质量控制体系提供参考。
1 材料
1.1 仪器 UV - 5200 PC 型紫外分光光度仪（上海元析仪器有限公司）；岛津AUW120D电子天平（日本岛津）。
1.2 试药 半枝莲药材（购于哈尔滨药材大市场，经黑龙江童医生儿童生物制药有限公司研发部执业中药师李娜鉴定为唇形科黄芩属多年生草本植物半枝莲），D101大孔树脂（山东东鸿化工有限公司），野黄芩苷对照品（含量以91.3%计，中国食品药品检定研究所， 批号：110842-201508）；所用试剂均为AR 级，水为自制纯化水。
2 方法与结果
2.1 含量测定的方法学建立
2.1.1 样品溶液的制备 取浓缩干燥后的半枝莲提取物，精密称定，加甲醇定容至100 ml，从中取1 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，做为样品溶液。
2.1.2 对照品溶液的制备 按《中国药典》2015版（一部）中半枝莲含量测定项下总黄酮的测定方法制备对照品溶液，取野黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成0.2 mg·ml-1的溶液，做为对照品溶液。
2.1.3 线性关系考察 精密量取2.1.2项下对照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 ml分别置 25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。以甲醇为空白，于335 nm 波长处测定吸光度。以浓度（X ，mg·ml- 1）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为：Y = 0.494X ，r=0.9992。结果表明野黄芩苷在浓度0.003 -0.016 mg·ml- 1 范围内与A线性关系良好。
2.1.4 总黄酮含量测定 称取浓缩干燥后的半枝莲提取物约1 g，精密称定，加甲醇定容至100 ml，从中取1 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，做为样品溶液，照标准曲线制备项下方法，自“ 以甲醇为空白”起，（《中国药典》2015版（一部）中半枝莲含量测定项下总黄酮的测定方法）依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中野黄芩苷的重量(mg)，计算，即得。
2.1.5 精密度试验 精密量取对照品溶液1.2ml，按2.1.3项下方法，连续测定6次，根据标准曲线计算野黄芩苷重量，结果RSD为1.23%，表明仪器精密度良好。
2.1.6 稳定性试验 精密量取2.1.4项下样品溶液，按2.1.3项下方法在360 min内,每隔60 min测定1次，结果RSD为0.98%，表明半枝莲提取物样品溶液在360 min内稳定性良好。
2.1.7 重复性试验 称取6份浓缩干燥后半枝莲提取物，精密称定，加甲醇定容至100 ml，从中取1 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，做为样品溶液，按2.1.3项下方法操作，测得半枝莲总黄酮含量的RSD为1.37%，表明该方法重复性良好。
2.1.8 加样回收率试验 将野黄芩苷对照品溶液加到最优提取工艺条件下得到的半枝莲提取物样品溶液中（黄芩苷含量为0.346 mg·ml-1)），按2.1.3项下方法测定，测得平均回收率为100.37%，RSD为1.55%（n=6）.
2.2 半枝莲总黄酮纯化工艺的考察
2.2.1 静态吸附试验 分别称取2种型号经预处理的树脂1.0 g,置于100 ml锥形瓶中，加入半枝莲总黄醇提取液50 ml(总黄酮浓度为3.98 mg·ml-1)，每隔10 min振摇20 s,持续2 h,静置24 h,抽滤得吸附后滤液，将吸附后的树脂滤出后，分别置100 ml锥形瓶中，加入70%乙醇各50 ml,同法操作，得解吸后的滤液，按2.1.3项下法测定半枝莲总黄酮浓度，计算树脂对总黄酮的静态饱和吸附量，洗脱
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结果表明虽然两种不同树脂对半枝莲总黄酮的解吸率相近，但D101型大孔树脂的饱和吸附量明显高于AB-8型，且成本较低，适合大生产使用，故采用D101型大孔树脂用于半枝莲总黄酮的纯化
2.2.2 上样液浓度的考察 精密称取处理好的D101大孔树脂4份（约合干树脂4g），分别加入已知浓度为5.0、3.5、2.5及1.5 mg·ml-1的半枝莲总黄酮提取溶液，以1.0 ml·min-1的流速上柱，吸附后，用纯化水洗脱至无色，再以60%乙醇溶液200 ml洗脱，收集洗脱液，测定总黄酮含量，结果上样浓度为3.5 mg·ml-1时半枝莲总黄酮收率明显高于其他浓度，故选择3.5 mg·ml-1上样浓度做为半枝莲总黄酮纯化工艺上样浓度。
2.2.3 上样液pH 精密称取处理好的D101大孔树脂4份（约合干树脂4 g）分别是加入已知含量的pH为2.0、3.0、4.0的样品溶液，以1.0 ml·min-1的流速上柱，吸附后，用纯化水洗脱至无色，再以60%乙醇溶液200 ml洗脱，收集洗脱液，测定总黄酮含量，结果表明pH为2.0时洗脱液中半枝莲总黄酮的收率最高，其原因可能为pH为2.0时黄酮类化合物以分子状态存在，树脂的吸附效率也最佳，故选择上样液的pH为2.0。
2.2.4 洗脱流速 精密称取处理好的D101大孔树脂4份（每份约合干树脂4 g），准确吸取已知浓度的样品溶液60 ml (总黄酮浓度为3.5 mg·ml-1)，以流速1.0 ml·min-1的流速上柱，吸附后用纯化水洗脱至无色，再以60%乙醇200 ml分别以1、 2、3及4 ml·min-1的流速进行洗脱，测定洗脱液中总黄酮浓度，计算洗脱量，结果表明洗脱流速为3 ml·min-1时洗脱量相对较大，其次为3 ml·min-1，但考虑到生产周期确定洗脱液流速为2 ml·min-1。
2.2.5 洗脱液浓度及用量 精密称取处理好的D101大孔树脂4份（每份约合干树脂4 g），准确吸取已知浓度的样品溶液60 ml (总黄酮浓度为3.5 mg·ml-1)，以流速1.0 ml·min-1的流速上柱，吸附后用纯化水洗脱至无色，再以20%、40%、60%、80%的乙醇各250 ml进行洗脱，流速为3 ml.min-1，每种洗脱液按100、50、50、50 ml分4段收洗脱液，测定洗脱液中总黄酮浓度，结果表明，60%及80%乙醇洗脱时得到的总黄酮收率最高，但考虑到60%与80%乙醇洗脱效果相差不大，且浓度高生产成本提高，故选择洗脱溶剂为60%乙醇，洗脱液收集量为200，ml时，总黄酮的收率已达到总收率的95%以上，故选择洗脱用量为200 ml，即20BV（柱体积）。
2.2.6 上样速度 精密称取处理好的D101大孔树脂4份（每份约合干树脂4g），准确吸取已知浓度的样品溶液60 ml (总黄酮浓度为3.5 mg.ml-1)，分别以2、3、4和5 BV.h-1的上样速度上样，吸附后用纯化水洗脱至无色，再以60%乙醇200 ml以3 ml.min-1的流速进行洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中总黄酮浓度，结果上样速度为2 BV.h-1时，总黄酮的收率最大，因此，选择2 BV.h-1进行上样。
2.3 半枝莲提取纯化工艺的验证试验 按最佳工艺条件，取半枝莲药材以8倍量的60%乙醇加热回流提取 2 次，每次 1.5h，提取液滤过，合并，回收乙醇，提取液浓缩，离心，取上清液，用HCL调pH至2.0（总黄酮浓度约为3.5 mg.ml-1）做为上样液，称取处理好的D101大孔树脂（约合干树脂10 g）装柱，以2 BV.h-1的流速上样，吸附完全后，以纯化水洗脱至无色，再以20 BV60%乙醇进行洗脱，重复操作3次，结果为所得到的总黄酮固形物中总黄酮平均含量为50.2%，总黄酮平均收率为2.73%。
3讨论
半枝莲含有多种化学成份，主要是黄酮类、生物碱、甾体以及酚类等，研究表明黄酮类成分为其主要活性成分,根据静态吸附实验结果，我们确定采用D101型大孔吸附树脂分离纯化半枝莲总黄酮。的最佳工艺为：以 pH为2.0，总黄酮浓度为3.5 mg.ml-1的溶液做为上样液，以2 BV.h-1的流速上样，吸附完全后，以纯化水洗脱至无色，再以20 BV60%乙醇进行洗脱。验证实验表明本方法总黄酮收率为2.73%，总黄酮固形物中总黄酮平均含量为50.2%。
【参考文献】
1.李宁，肖海涛,孟大利，等.半枝莲的化学成分[J].中国现代中药,2009，12(11):16-18
2.文 蜀，周亚伟，叶蕴华，等．半枝莲中黄酮类化学成分研究[J]．中国中药杂志，2004，29(10)：957-959
3.刘 烨，陈 波，姚守拙．大孔吸附树脂分离纯化4种主要大豆异黄酮[J]．中南药学，2007，5(4)：289—291