摘要目的探讨呼吸道病原体核酸微流控恒温扩增芯片在下呼吸道常见病原体检测中的临床应用价值。方法收集昆明医科大学第一附属医院2018年1月-12月疑似下呼吸道感染患者的支气管分泌物标本626例，采用微流控恒温扩增芯片及常规病原体培养等方法分别进行检测，然后进行比较分析。结果在626例标本中，芯片法检出病原体269例，未检出357例，检出率为42.97%；培养法检出160例，未检出466例，检出率为25.56%，芯片法显著高于培养法（P<0.001）。以培养法为金标准，芯片法的灵敏度为70%，特异度为67%，阳性预测值为42%，阴性预测值为87%，两种方法的总符合率为68%。结论芯片法的阳性率高于传统培养法、检测周转时间明显短于培养法，可作为传统病原体培养法的有效补充，用于下呼吸道常见病原体的快速检测。
关键词：呼吸道病原体核酸恒温扩增芯片法十三联检；病原体分离和培养法；下呼吸道；病原体；临床应用
Clinical application value of respiratory pathogen nucleic acid constant temperature amplification chip method in detection of lower respiratory tract pathogens
Abstract Objective We are going to investigate the clinical application value of thirteen combined detection of respiratory pathogen nucleic acid constant temperature amplification chip method in the detection of lower respiratory tract pathogens . Methods A total of 626 cases of bronchial secretions from patients with suspected lower respiratory tract infection from January to December 2018 in the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University were collected. Thirty-three pathogens in the specimens were detected by isothermal amplification chip method and pathogen isolation and culture, it is compared with the constant temperature amplification chip method to judge its application value in clinical practice. RESULTS: A total of 269 cases were detected by the simultaneous amplification of the microarray method, and 357 cases were not detected. The detection rate was 42.97%. 160 cases were detected by culture method, and 466 cases were not detected. The detection rate was 25.56%. The positive rate of constant temperature amplification microarray method is higher than that of traditional pathogen isolation and culture methods（P<0.001).The sensitivity of the 13-degree joint test of the constant temperature amplification chip method was 70%, the specificity was 67%, the positive predictive value was 42%, and the negative predictive value was 87%. The total compliance rate of the two methods was 68%. Conclusion The positive rate of constant temperature amplification microarray method is higher than that of traditional pathogen isolation and culture methods, not only shorten the TAT of clinical microbiological examination, but also provide a rapid and accurate laboratory diagnosis basis for the diagnosis of clinical infectious diseases.
据世界卫生组织（WHO）统计，全球因感染性疾病死亡的病例数约占死亡病例总数的1/3，而急性呼吸道感染的死亡例数占所有感染性疾病死亡病例数的1/4，居人类死因第三位[1]。下呼吸道感染（Lower respiratory tract infection,LRTI）是指声门以下的气道感染，包括支气管炎、肺炎、慢性阻塞性肺病、支气管扩张合并感染、间质性肺疾病、支气管哮喘等，常以咳嗽、发热甚至呼吸困难为最主要临床表现。引起下呼吸道感染的病原体主要有细菌、病毒、支原体、衣原体等[2,3]。目前，病原体的确诊主要依靠病原体的分离与培养，但其操作繁琐、耗时长、灵敏度低，对HIN、LP、MP和CP等不易培养的病原体的检出率低。因此，迫切需要建立一种快速、准确、敏感、特异的病原体诊断方法。本研究以恒温扩增芯片法检测下呼吸道13种病原体，并于传统病原体分离与培养进行比较，旨在探讨恒温扩增芯片法在临床诊断系呼吸道感染性疾病中的应用价值。
1 材料与方法
1.1 样本收集昆明医科大学第一附属医院2018年1月-12月疑是下呼吸道感染患者的支气管分泌物标本626例，采集样本量不少于0.6ml，置于相应的无菌样本收集管内，常温保存和转运。
1.2 试剂和仪器呼吸道病原菌核酸检测试剂盒及RTisochipTM恒温扩增微流控芯片核酸分析仪购自博奥生物集团有限公司。血平板和巧克力平板购自郑州安图公司，麦康凯平板购自法国梅里埃公司。GP、GN鉴定卡和VITEK2-Compact全自动微生物检定仪购自法国梅里埃公司。
1.3 方法
1.3.1 呼吸道病原菌核酸微流控恒温扩增芯片该芯片能同时检测13种常见的下呼吸道感染病原体，分别为肺炎链球菌（S.P）、金黄色葡萄球菌（S.a）、大肠埃希菌（E.coli）、肺炎克雷伯菌（Kpn）、铜绿假单胞菌（PA）、鲍曼不动杆菌（CSBA）、嗜麦芽窄食单胞菌（SMA）、流感嗜血杆菌（HIN）、嗜肺军团菌（LP）、肺炎支原体（MP）、肺炎衣原体（CP）、耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA）和结核分枝杆菌。提取支气管分泌物样本的核酸，采用恒温扩增、微流控蝶式芯片相结合的技术，利用具有链置换功能的聚合酶在恒温（65℃）条件下进行靶核酸扩增，扩增过程中通过荧光染料掺入进行实时荧光检测，应用RTisochipTM恒温扩增微流控芯片核酸分析仪和相应软件进行结果分析。
1.3.2 病原体的分离、培养和鉴定用一次性接种环挑取适量的分泌物接种于血平板、麦康凯和巧克力平板上，分区划线后置于35-37℃过夜培养。观察细菌菌落形态，对不同的细菌进行鉴定。将菌液浊度调制0.5-0.62MCF，革兰阳性球菌上GP鉴定卡，革兰阴性菌上GN鉴定卡。
1.3.3 统计分析使用SPSS22.0统计软件，两种方法间的比较采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
恒温扩增芯片法十三联检检出269例，未检出357例，检出率为42.97%；培养法检出160例，未检出466例，检出率为25.56%（P<0.001）。恒温扩增芯片法十三联检的灵敏度为70%，特异度为67%，阳性预测值为42%，阴性预测值为87%,两种方法的总符合率为68%（表1）。培养阳性但十三联阴性共47例，其中非十三联目标菌27例，十三联目标菌20例；十三联阳性但培养阴性共156例，其中量多的依次为流感嗜血杆菌63例、耐甲氧西林葡萄球菌39例、肺炎链球菌18例；不易培养菌为嗜肺军团菌1例、肺炎衣原体1例。
[1]2种方法的差异性分析：十三联、培养均阳性113例，其中完全符合（检出菌种类和数量均一致）35例；不完全符合（检出菌种类/数量不完全一致）43例，其中38例为13联检出的菌种数量多于培养，1例为培养检出的菌种数量多于13联，4例为两种方法检出的菌种有所不同；2种方法检出菌种完全不一致有35例，其中25例为培养检出的菌种非13联的目标菌，且13联检出的菌种并未被培养出来；剩余1：0个病例，培养检出的菌种在13联的目标菌内，但2种方法检出的菌种完全不一致；13联从35例中检出耐甲痒西林葡萄球菌，但无一例被培养检出。
TAT的结果分析:恒温扩增芯片法检测肺泡灌洗液和痰标本只需2h,而常规普通细菌培养需要24~36h左右, 因此恒温扩增芯片法大幅度缩短了TAT时间。
表1十三联检与培养法对各病原体检测的符合率比较
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3 讨论
传统细菌培养法操作复杂、检测周期长（一般3-4天），较难满足临床需求。在获得培养结果前，临床抗感染治疗往往是经验性用药，这可能导致患者对某些抗生素产生耐药性，使得后续治疗失败。因此，迫切需要发掘快速诊断病原体的方法。十三联检恒温扩增芯片法的特点是针对靶基因的6个区域设计4对特异性引物，利用链置换DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶）在恒温条件下（65℃左右）经过非循环起始阶段、环扩增阶段、循环延伸阶段，最终形成一系列有多个靶DNA反向重复序列串联的不同大小的产物，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等步骤，整个过程15-60min即可完成[4-6]。本研究通过与培养法比较，结果显示芯片法的阳性率高于传统培养法、检测周转时间明显短于培养法，可作为传统病原体培养法的有效补充，用于下呼吸道常见病原体的快速检测。
本研究对626例疑是下呼吸道感染的患者支气管分泌物进行十三联检测和细菌培养，恒温扩增芯片法十三联检检出269例，未检出357例，检出率为42.97%，影响其检出率的主要原因包括：1.患者并非感染13种目标病原菌；2.患者感染的是13种目标病原菌，但标本采集不合格如未采集到病灶分泌物、口水，导致未采集到病原菌或病原菌量低于检测限。培养法检出160例，未检出466例，检出率为25.56%，影响其检出率的原因主要是：1.标本采集不合格，未采集到病原菌；2.患者检测前使用了抗生素；3.标本保存不正确/运送不及时，导致病原菌死亡。培养阳性但十三联阴性共47例，其中非十三联目标菌27例，十三联目标菌20例，芯片法未检出目标菌的主要原因有：1.操作失误，导致检测失败；2.标本不合格，未采集到病原菌或病原菌量低于检测限。十三联阳性但培养阴性共156例，其中检出率排前3位的依次为流感嗜血杆菌63例、耐甲氧西林葡萄球菌39例、肺炎链球菌18例；不易培养菌包括嗜肺军团菌1例、肺炎衣原体1例。培养未检出的主要原因包括：1.标本采集不合格，未采集到病原菌；2.患者检测前使用了抗生素；3.标本保存不正确或运送不及时，导致病原菌死亡。至于13联从35例病例中检出耐甲痒西林葡萄球菌，但无一例被培养检出，其原因可能是本试剂盒检测的耐甲氧西林葡萄球菌经过耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、耐甲氧西林溶血葡萄球菌、耐甲氧西林人葡萄球菌、耐甲氧西林路邓葡萄球菌验证，培养法针对支气管分泌物的耐甲氧西林葡萄球菌只检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌这一种。
虽然培养被视为金标准，但其存在自身的不足，只有活菌才有可能被培养，因此其最主要受到检测前抗生素的使用、标本保存的正确性及运送的及时性的影响。十三联检出、但培养未检出达到156例，虽然从统计上看这些结果属于假阳性结果，但结合临床及培养自身的局限性看，这156例并非假阳性结果。
恒温扩增芯片法较细菌培养法, 可快速诊断感染病原菌, 并提高阳性率;并可检测支原体、衣原体、军团菌等病原体[7]。恒温扩增芯片法目前还无法提供病原体的药敏信息、检测的目标菌有限,这也是它的缺点,恒温扩增芯片法检测周转时间明显短于培养法，可作为传统病原菌培养法的有效补充，用于下呼吸道常见病原体的快速检测。
参考文献
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