摘要：目的 探析不同浓度绿茶溶液对糖尿病患病机制的影响。方法 采用高脂饲料结合腹腔注射链脲佐菌素（STZ)的方法建立2型糖尿病小鼠模型，连续灌胃绿茶溶液40d后检测小鼠空腹血糖量、葡萄糖耐受量、血脂、肝功能等指标，观察组织形态。结果 绿茶溶液可有效调节2型糖尿病小鼠高血糖和血脂代谢紊乱的症状，改善2型糖尿病小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C等相关因子水平（p<0.01)，降低血清中AST、ALT活性（p<0.01)，修复糖尿病小鼠胰岛、肝脏组织细胞形态。结论 一定浓度的绿茶溶液（50~150mg/kg)对STZ诱导的2型糖尿病小鼠模型具有降血糖作用。
关键词：绿茶；糖尿病；血糖
随着社会经济的飞速发展和人民生活水平的显著提高，糖尿病（diabetes mellitus，DM)患者的数量在中国也不断增多。据IDF统计，2017年全球糖尿病患者己达4.25亿人，其中我国糖尿病患者人数约达1.1亿人，在目前全球DM数量排名中，位居首位。预计到2045年，将会有6.93亿的18?99岁人群，或6.29亿的20?79岁人群患有糖尿病[1]。目前市场上治疗糖尿病的主流药物有11种，它们虽然能较好的抑制病情恶化，却会引起一系列的不良反应。从近几年人体和动物实验表明，许多我们普遍正在消费的茶叶及其部分生化成分具有较好的降血糖效果[2]。茶叶具有良好的降血糖功能，在体内、体外实验中均表现出很强的作用效果可能与茶叶中的多种活性成分及其协同作用有关，包括茶多糖、茶多酚、茶色素、咖啡碱等成分。当前茶叶作为一种天然降血糖材料己经被国内外学者广泛关注，其降血糖的机制可归纳为以下几点[3-4]：（1)抑制a-葡萄糖苷酶活性，延缓葡萄糖吸收；（2)改善糖代谢相关酶活性：（3)调节自身免疫，清除自由基，防止脂质过氧化；（4)改善胰岛细胞形态和功能，促进胰岛素分泌；（5)提高胰岛素敏感性；(6)改善糖代谢，促进肝脏、肌肉等外周组织和靶器官对糖的利用，（7)抑制小肠内葡萄糖运转载体SGLT-1的活性，延缓糖的吸收。但在众多茶叶生化成分降糖功效的研究中，绿茶降血糖功效的研究还少未见报道。因此本试验选用绿茶作为原材料，设置3个不同浓度梯度干预链脲佐菌素(Streptozocm，STZ)诱导的糖尿病模型小鼠，通过检测血糖、血脂四项、肝功能等指标，系统评估绿茶溶液对糖尿病小鼠血糖的影响，以期检验绿茶溶液是否具有调节血糖的功能作用，为糖尿病的临床治疗及新药研发提供理论依据。
1材料与方法
1.1 试验材料
SPF级成年雄性健康小鼠，共60只，体重（100±20)g，于长沙医学院实验动物中心SPF饲养。室温22?26°C，相对湿度40%?70%，分笼饲养，每笼5只。明暗交替条件为12h/12h。固定时间添加足量饲料与饮水，高脂高糖饲料采购于北京博爱港商贸有限公司，配方如下：66.5%小鼠维持饲料+10%猪油+20%蔗糖+2.5%胆固醇+1%胆酸钠。链脲佐菌素(Streptozocin，STZ，纯度彡99%，批号：S0130-1G，北京博爱港商贸有限公司）；盐酸二甲双胍片（白云山汤阴东泰药业有限责任公司）；水合氯醛（分析纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司）；4%多聚甲醛通用型组织固定液（Biosharp)。
1.2仪器与设备
JCS-W型电子天平（哈尔滨众汇衡器有限公司）；易准血糖测试仪（三诺生物传感技术股份有限公司）；KDC-2046低速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；日立7180全自动生化分析仪（北京泰林东方商贸有限公司）。
1.3试验方法
1.3.1 2型糖尿病模型的建立及分组
小鼠分笼饲养，普通饲料适应性喂养4周，室温20?25°C，相对湿度55%?70%。除对照正常组小鼠外均高脂高糖饲料喂养4周后禁食12h，将STZ在冰浴条件下，溶于0.1mol/L柠檬酸和柠檬酸钠试剂缓冲液（pH4.2-4.5)，参考林心君等人体重联合体表面积法的糖尿病小鼠造模方法，尾静脉注射STZ溶液。72h后测定血糖值，以空腹血糖≥11.1mmol/L且伴随表现出“三多一少”、毛色暗淡、运动量减少等特征为糖尿病小鼠造模成功。将造模成功的小鼠随机分为5组：阴性对照组（模型组）、阳性治疗对照组（二甲双胍）、高剂量组、中剂量组、低剂量组。
1.3.2日常饲养与灌胃给药
将绿茶溶液与二甲双胍溶于5%羧甲基纤维素钠配置成溶液后进行灌胃。正常组以基础饲料喂养，并灌胃1ml5%羧甲基纤维素钠溶液，无其他药物干预；阴性对照组喂饲高糖高脂饲料，并灌胃1ml5%羧甲基纤维素钠溶液，无其他药物干预；阳性对照组喂饲高糖高脂饲料，以每日200mg/(kg bw d)剂量灌胃二甲双胍；高、中、低剂量治疗组饲喂高糖高脂饲料，绿茶溶液灌胃剂量分别为150mg/(kg bw d)、100mg/(kg bw d)、50mg/(kg bw d)。日常饲养期间自由饮水摄食，6组试验组的小鼠每日按时以灌胃的方式给药，共需灌胃40d。
1.3.3日常观察指标在试验的过程中，每日观察动物精神状态、活动情况及毛色光泽度等，每周定量测定进食量及体重，观察其体重的变化。
1.3.4空腹血糖的测定及口服葡萄糖耐受实验
将小鼠禁食不禁水6h后，以尾静脉取血的方式测定小鼠给药前、给药10、20、30、40d后的空腹血糖值。试验即将结束时，将所有小鼠禁食不禁水12h后给小鼠灌胃葡萄糖1.5g.kg-1，之后测定各组小鼠喂饲葡萄糖后0，30，60，120min的血糖值。
1.3.5血清指标测定
给药40d后，结束灌胃。空腹12h，在消毒的情况下，小鼠腹腔注射10%水合氯醛（2mlkg-1)进行麻醉，腹主动脉取血，常温静置30min后，放到低速冷冻离心机，4T离心，取上层血清。委托长沙医学院附属第一医院采用全自动生化仪测定甘油三酯（Triglyceride，丁G)、总胆固醇（Total Cholesterol，TC)、低密度脂蛋白-胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白-胆固醇（High-density lipoprotein cholestero，HDL-C、肝功能指标天门冬氨酸氨基转移酶（AST)、丙氨酸氨基转移酶（ALT)的活性。
1.4 统计分析方法
数据采用SPSS21.0软件对实验数据进行分析，数据均用表示，以单因素方差分析法比较两组间差异。
2结果与分析
2.1—般日常观察及体重变化
试验期间，小鼠的精神状态保持良好，具有较强的行动力。正常组的小鼠皮毛光滑，试验前后进食量、饮水量几乎不变，体重呈上升趋势。模型组小鼠精神萎靡，呈现明显的多食、多饮和多尿等症状，皮毛暗淡无光部分呈浅褐色，体重下降幅度较大。经过阳性治疗对照组（二甲双胍）及绿茶溶液组在灌胃之后的一段时间，皮毛的光泽度提升，活动正常且体重下降幅度减少，后期体重呈现一定程度的回升，以高剂量组效果较为明显。实验期间各组均未出现实验动物非正常死亡。
2.2绿茶溶液对糖尿病小鼠空腹血糖的影响 血糖升高是2型糖尿病的主要特征之一，其症状体现为持续的血糖升高，并会在一定程度上导致机体糖代谢紊乱，产生糖毒性，血糖值侧面反应了胰岛B细胞对胰岛素的分泌功能。给药前后糖尿病小鼠空腹血糖值变化如表2所示。由表可知，不同时期，正常组小鼠与模型组小鼠血糖值波动范围较小，血糖值较为稳定。而药物处理组小鼠血糖变化较为显著，其中阳性对照组小鼠血糖变化范围最大，降幅达41.46%;高、中、低剂量组小鼠也都呈现出一定降低血糖的效果，且血糖波动幅度与给药浓度呈正相关。综上，影响空腹血糖的效果为：阳性治疗对照组（二甲双胍）>高剂量组>中剂量组>低剂量组>模型组，且经过绿茶溶液干预40d的糖尿病小鼠血糖值与模型组呈现极显著差异(P<0.01)，绿茶中、高剂量灌胃后的糖尿病小鼠血糖降幅高于低剂量，但中、高剂量组间差异不大。
表2绿茶溶液对高血糖小鼠血糖的影响（）
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注：（1)0d表处理前血糖值，10d、20d、30d和40d分别为给药10、20、30和40天时的血糖值；（2)模型组与正常组对照，△△代表极显著差异（P<0.01);给药组与模型组对照，*代表显著性差异（p<0.05)，**代表极显著差异（P<0.01)。
2.3绿茶溶液对糖尿病小鼠糖耐量的影响
糖耐量即对葡萄糖的耐受能力，通过对糖耐量的检测，可以了解机体对糖的吸收利用水平。由于机体内需要对葡萄糖进行代谢贮存，因此正常情况下服用一定量葡萄糖后，血糖浓度会先升高随后在一定时间内恢复到空腹水平。若服糖120min后机体血糖浓度仍然保持较高水平，说明糖耐量能力降低，即对糖的吸收利用低于正常人。给药40d后观察到，阳性治疗对照组与绿茶溶液组显示出较好的降低糖尿病小鼠空腹血糖的作用（p<0.01)。在给药第38天时检测试验性小鼠糖耐量，结果表明，模型组小鼠在糖负荷0，30，60和120min后的血糖值显著高于正常对照组糖负荷后血糖值，糖尿病小鼠血糖值在前30min间快速升高，并达到峰值，随后缓慢下降，在120min时接近起始值，该时刻绿茶溶液低、中剂量组小鼠血糖与模型组小鼠血糖呈现显著性差异（P<0.05)，绿茶溶液高剂量组、阳性对照组与模型组小鼠血糖差异极显著性（p<0.05)。其中模型组AUC面积最大，绿茶溶液组的AUC面积大小与绿茶溶液浓度呈反比，且阳性对照组和绿茶溶液组的AUC与模型组呈现出极显著的差异（P<0.01)。
表3绿茶溶液对高血糖小鼠糖耐量的影响（）
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30.89±2.72**
注：（1)0min表处理前血糖值，30min、60min、120min分别为灌胃葡萄糖后30分钟、60分钟、120分钟的血糖值；（2)模型组与正常组对照，△△代表极显著差异（P<0.01);给药组与模型组对照，代表显著性差异（P<0.05)，**代表极显著差异（P<0.01)。
2.4绿茶溶液对糖尿病小鼠血脂的影响
血脂是人体血浆中产生沉积的脂类物质，一般可概括为：三酰甘油、胆固醇、P-脂蛋白、磷脂和游离脂酸等血脂的变化可以反映出体内脂质代谢的情况[5]。而脂蛋白是指与脂类结合在一起的蛋白质，其中低密度脂蛋白（LDL-C)是将肝脏合成的胆固醇转运到全身组织的主要形式，因此低密度脂蛋白增高必然伴随胆固醇总量的增高；高密度脂蛋白（HDL-C)颗粒较小，蛋白质含量最高，胆固醇含量会随着高密度脂蛋白的减少而增高[6]。给药40d后，与正常组对比，模型组的小鼠TC、TG、HDL-C含量均升高，且具有极显著差异性（P<0.01)，LDL-C含量下降，这证明糖尿病小鼠己经出现了脂代谢紊乱的情况。对比模型组，绿茶溶液各剂量组空腹TC、TG、HDL-C呈现出及显著差异（P<0.01)，LDL-C含量随绿茶溶液浓度增加而呈现下降趋势，说明绿茶溶液对糖尿病小鼠的脂代谢紊乱具有较好的调节作用。研究发现，正常组小鼠血清HDL-C含量最低，推测可能是因为正常组的小鼠在动物房笼内活动量少造成肥胖，造成正常组小鼠血清HDL-C含量下降，而模型组的LDL-C含量最低，推测是因为模型组小鼠后期体重下降，因此造成血清LDL-C含量下降。
表4绿茶溶液对高血糖小鼠血脂的影响（）
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注：*与△分别代表不同组别间血脂四项浓度的比较，模型组与正常组讨照，△△代表极显著差异（P<0.01);给药组与模型组对照，*代表显著性差异（P<0.05), **代表极显著差异（P<0.01)。
2.5绿茶溶液对糖尿病小鼠肝功能的影响
肝脏作为调节血糖最重要的器宫，肝功能在糖尿病治疗中的作用正被更多的人关注。天门冬氨酸氨基转移酶（AS1)、丙氨酸氨基转移酶（ALT)是反映肝脏功能的关键指标，可以一定程度上反应肝细胞受损情况及损伤程度[7]。不同处理小鼠血清中AST、ALT活性如表5所示。模型组AST与ALT活性最高，与其他组呈极显著差异（P<0.01);除正常组外，高剂量组与阳性对照组活性最低，且AST、ALT的活性随绿茶溶液灌胃浓度的升高而呈下降趋势。说明绿茶溶液高、中、低剂量组与阳性对照组能很好的降低糖尿病小鼠AST、ALT的活性。模型组AST、ALT的比值与正常组呈现极显著差异（P<0.01)，但与其他药物处理组并没有呈现出显著差异。
表5绿茶溶液对糖尿病小鼠血清AST、ALT活性的影响（）
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注:*与△分别代表不同组别间ALT、AST活性的比较，模型组与正常组对照，△△代表极显著差异（P<0.01)；给药组与模型组对照，*代表显著性差异（P<0.05)，**代表极显著差异（P<0.01)。
3结论
2型糖尿病作为遗传因素和环境因素共同作用而形成的多基因遗传性疾病，是一种复杂的异质性糖代谢性疾病，可引起多器官或组织功能失调，且发病率逐年升高[8]。而在生物活性成分降血糖研究中，以STZ诱导的糖尿病小鼠模型最为常用。STZ会使得胰岛p细胞功能受损、胰岛素合成减少，从而引发糖尿病。与此同时，由于血糖升高而导致的机体脂质代谢紊乱也会加重胰岛p细胞损伤，导致病情持续恶化[9]。本研究结果表明，适当剂量的绿茶溶液（50?150mg/kg)能有效降低STZ诱导的糖尿病小鼠的空腹血糖、调节糖脂代谢、增强其葡萄糖耐受程度，且其效果与剂量浓度成正比。该结果与栾[10]之等人对茶花抑制血糖水平的研究结论一致。研究发现，正常组小鼠血清HDL-C含量偏低，而模型组的LDL-C含量偏低，己有研究表明[11]体重的过高会导致HDL-C含量的降低，体重过低的机体LDL-C含量会低于体重正常的机体，因此推测是因为正常组、模型组小鼠后期体重的变化，造成血清HDL-C、LDL-C含量的异常，其变化机制还有待进一步验证。胰腺内胰岛中央区的p细胞是胰岛素表达的主要场所。虽然目前2型糖尿病的发病机制尚未完全明确，但经过前人的研究发现2型糖尿病的发病因素与胰岛素抵抗和胰岛p细胞受损有密切关系[12]。本研究采用HE染色法观察糖尿病小鼠胰岛组织形态，结果显示，绿茶溶液可使STZ诱导的糖尿病小鼠胰岛细胞破坏、空泡化现象得到改善。
肝脏作为调节血糖浓度的主要器官，参与糖的代谢过程。本研究结果显示，绿茶可以降低糖尿病小鼠体内ASL、ALT活性，同时能修复小鼠肝脏细胞溶解现象，使得肝脏细胞边缘轮廓清晰，细胞核数量增多[13]。这一结果表明，绿茶溶液能兼顾有效护肝，使其发挥血糖调节功能，目前该作用机理仍有待进一步研究检验。许多流行病学调查结果显示，饮茶能够降低患糖尿病的风险 。饮茶能够降低血糖的水平，可作为保障公众健康的重要措施应用到日常生活中，包括绿茶、乌龙茶和红茶在内的许多茶类，都具有增强胰岛素活力的作用，但是功效成分却不尽相同，绿茶和乌龙茶的主要功能成分是EGCG，而红茶功效却来自EGCG、ECG、茶黄素等多种功能成分的共同作用。Tsuneki等对普通人群的糖耐量测试结果表明，绿茶能够促进人体内的糖类代谢；其开展的动物实验表明，绿茶能够降低糖尿病小鼠和链脲霉素糖尿病小鼠的血糖水平。Islam等以绿茶喂食链脲霉素诱导的糖尿病小鼠，发现小鼠血清中胰岛素水平显著增高，表明绿茶能够促进胰岛素的分泌，从而减弱链脲霉素对胰岛β细胞的损伤。研究发现，茶多糖可减轻四氧嘧啶糖尿病小鼠的氧化应激，对糖尿病模型小鼠的胰岛组织有保护作用，同时茶多糖能够显著增加链脲霉素损伤MIN-6细胞的胰岛素分泌量，抑制细胞线粒体跨膜电位的下降趋势，阻止细胞凋亡，显著改善DNA 损伤，从而具有保护 MIN-6 细胞的作用。茶多酚是茶叶中最为重要的保健功能成分，是指存在于茶叶中的多元酚类混合物。以儿茶素为主体的黄烷醇类物质，约占茶多酚类总量的70%以上，在降血糖功效方面起重要作用，甚至有可能应用于治疗Ⅱ型糖尿病的辅助治疗[14]。茶多酚调节糖代谢的可能作用机制有：改善胰岛素抵抗、提高胰岛素敏感性，类α-葡萄糖苷酶抑制剂作用，类噻唑烷二酮类作用，影响酶与转录因子的活性与表达，促进靶组织对葡萄糖的吸收与利用等。国外研究发现，绿茶多酚能够降低血糖水平和改善肝肾功能，改善糖尿病病情，可能与抑制脂质过氧化、清除羟自由基和氧自由基等能力有关。并且能够辅助恢复胰岛β细胞的分泌功能此外，茶多酚和茶多糖对糖尿病还有很好的协同防治作用。
绿茶含有苷元和，苷元为齐墩果烷型，糖链结构和链接位置的不同导致这些化合物具有不同的药理活性。3位糖苷键普遍被认为是齐墩果烷型皂苷具有抗肿瘤、降血糖等药理作用的活性部位，据己有研究显示[15]，绿茶溶液的糖苷键链接在3位取代基上。当前关于绿茶皂苷降血糖的研究主要集中在达玛烷型皂苷，且对人参、西洋参、三七和绞股蓝等中的达玛烷型皂苷降血糖方面的研究较为成熟，对齐墩果烷型皂苷降血糖功效研究较少。研究表明[16]其抑制血糖的作用机理与根皮苷类似，能通过抑制小肠对糖的吸收，从而提高糖尿病2型病人的葡萄糖耐量。因此本研究下一步将对其具体作用部位和机理进行探讨。
综上所述，本研究结果显示长期适当剂量的绿茶溶液（50?150mg/kg，浓度50%—80%)干预可以有效调节糖尿病小鼠的血糖水平。绿茶可以通过修复胰岛损伤、肝脏损伤，调节糖尿病小鼠糖脂代谢、改善葡萄糖耐受。在化学制品主导的降血糖药物市场，绿茶因其所具备的护肝降糖效应，有望为糖尿病患者提供安全有效的护肝降糖辅助治疗选择。
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