【摘 要】目的：研究西格列汀药品阻止或者延缓2型糖尿病肾病的效果，确定相应进展与可能的机制。方法：通过小剂量链脲佐菌素进行诱导，同时形成高脂饲养条件，以此形成大鼠的DN模型，完全成模之后，分成SIT组与DN组，分别指西格列汀组与模型组，另外还设置对照组为NC组。连续12周对实验对象实施灌胃处理，获取其肾组织，实施检测工作，确定肾脏的实际纤维化程度，通过其他的检测方法对肾组织的表达情况进行确定，最后确定蛋白含量时运用免疫组化法的检测方式。结果：对比对照组，模型组的NF-κB、TLR4与TLR2都有所增加，同时纤维化程度也有所增强，对比西格列汀组与模型组，其相应指标降低。结论：根据本次实验可以确定，西格列汀可对存在DN症状的大鼠体内的肾纤维形成影响，其运行机制极大可能与抑制NF-κB、TLR2与TLR4出现过度活化情况存在关联。
【关键词】西格列汀；2型糖尿病肾病；研究进展；实验
糖尿病肾病具有复杂化的发病机制，经过已有的临床研究材料可知，糖尿病肾病出现与后续发展过程中，炎症可能会直接参与其中。在对这种复杂疾病实施治疗时，可运用西格列汀药品，与其他同类药品相比，该药品能够对患者的神经系统与心血管起到保护作用，同时该药物被运用存在DN病症的实验大鼠上，可减轻其肾缺血与在灌注活动造成的损伤，对于西格列汀治疗DN患者的机制与影响方面的研究相对偏少，本文根据存在同类疾病的大鼠模型展开实验研究，确定西格列汀具体可形成的影响，确定其可能形成的作用机制。
1 材料与方法
1.1 一般材料
动物：健康SD大鼠30只，雄性，体重(180±20)g，SPF级。
药品：西格列汀，规格：每片100mg；链脲佐菌素，规格：每瓶1g。
仪器：OneTouch血糖仪；GI2200Pro凝胶成像系统。
1.2 方法
初期需要形成大鼠DN模型，需要30只性别为雄性的大鼠，随机划分大鼠的组别，高脂组中设置20只大鼠，对照组大鼠的数量为10只。针对对照组中研究对象，主要给予普通的鼠饲料，而高脂组大鼠则接受高脂类饮食。经过4周时间后，两组大鼠需进行禁食，禁食时间为12h，将链脲佐菌素注射给高脂组的所有大鼠，用量为30mg·kg-1，将枸橼酸缓冲液注射给对照组的大鼠，pH值为4.4 ，注射量需保持与注射对象等体积。
一周后，空腹血糖(FBG)<7．8mmol·L-1的大鼠再次腹腔注射30mg·kg-1链脲佐菌素。每周检测一次大鼠FBG，4周后，将两次FBGI>7．8mmol·L-1或一次FBG≥11．1mmol·L-1的判为2型糖尿病大鼠。
将存在DN症状的大鼠按照随机分组的方法划分为SIT组与DN组，组中大鼠数量分别为8只与9只，采用不同的处理方式，针对SIT组，需每日用西格列汀药品来进行灌胃，用量为10mg·kg-1，急NC组与DN组大鼠数量均为9只，运用NaCl药品进行同样的灌胃操作，用量为与使用对象等体积。连续进行12周的灌胃活动，每组剩余大鼠的数量均为6只，将其处死之后，获取肾组织，进行后续检测工作。
用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，切片厚度4μm。脱蜡后，用Masson染色，在200倍光学显微镜下观察，细胞呈红色，胶原纤维呈蓝绿色，用Image—ProPlus5．0图像处理系统测量胶原纤维阳性区占所观察视野的面积比。
反转录PCR法检测肾组织Toll样受体(TLR)2、TLR4、核转录因子一KB(NF—κB)mRNA的表达：取总RNA1μg进行反转录PCR反应。用凝胶成像系统对每一标本的PCR产物扩增的特异性片段进行灰度扫描，用TLR2、TIR4、NF—KB的灰度值与β—actin的比值表示目的基因TLR2、TLR4、NF—KB的相对表达量。
免疫组化法检测肾组织TLR2、TLR4蛋白的含量：肾组织石蜡包块制作切片，厚度4m。
用免疫组织化学法检测TLR2、TIR4蛋白含量，抗体按1：200的方法稀释，在200倍光学微镜下观察，阳性区出现棕黄色颗粒，用Image—ProPlus5．0图像处理系统测量TLR2、TLR4蛋白的平均积分光密度。
Western blotting法检测肾组织NF—κB蛋白的含量提取肾组织总蛋白后，定量，取蛋白样本70μI样进行凝胶电泳后转膜，封闭液封闭lh，一抗(1：200)4℃过夜，荧光二抗37℃孵育2h，红外成像系统拍照，以NF—κB的灰度值与B—actin的比值表示NF—κB的相对表达量。
2 结果
NC组大鼠肾组织可见少许胶原纤维沉积，DN组大鼠胶原纤维沉积明，SIT组胶原沉积有所减轻。与NC组相比，DN组大鼠肾组织胶原纤维显著增多，差异有统计学意义(P<0．01)；与DN组比，SIT组大鼠胶原纤维减少，差异有统计学意义(P<0．05)。
肾组织反转录PCR的结果：与NC组相比，DN组大鼠肾组织TLR2、TLR4、NF—κB mRNA表达均显著升高，差异有统计学意义(P<0．01)。与DN相比较，SIT组大鼠肾组织TLR2、TIJR4、NF—κB mRNA表达均显著降低，差异有统计学意义(P<0．05)，说明SIT有抑制TLR2、TLR4、NF—κB mRNA表达的作用。
肾组织免疫组化的结果：NC组大鼠肾组织TLR2、TLR4低表达，阳性颗粒散在，染色较浅；DN组高表达，棕黄色信号强，融合成片，而SIT组表达显著降低。与NC组相比，TLR2、TLR4的表达在DN组中明显升高，差异有统计学意义。与DN组相比，SIT 组的TLR2与TLR4表达显著降低。
相比NC组的情况，DN组中，对大鼠的肾组织实施检测后，可确定NF-κB这种蛋白质的含量被有效提升；对比DN组与SIT组，同样检测大鼠的肾组织，发现其同种蛋白质的含量有所降低，差异明显，可以确定西格列汀药品在抑制这种蛋白表达时的效用。
3 讨论
糖尿病是由多种原因所引起的以慢性高血糖症和微血管并发症为特征的一组代谢紊乱性疾病，其关键特征是胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷。细胞凋亡、炎症和氧化应激是胰岛素抵抗和β细胞功能障碍的关键机制，参与了糖尿病的整体恶化。糖尿病肾病是糖尿病严重的慢性微血管并发症之一，其发病机制复杂，目前普遍认为高血糖是导致肾脏代谢、血流动力学异常甚至损伤的主要原因，其早期病理特征主要包括肾小球肥大、肾小球和肾小管毛细血管基底膜增厚及系膜区细胞外基质的过度积累，后期进展为肾小球硬化和肾小管间质纤维化，临床早期表现为肾小球滤过压升高、滤过率降低，出现微量白蛋白尿、高血压、水肿甚至体液潴留，最终发展为肾衰竭。糖尿病肾病是终末期肾病最常见的原因，也是全球糖尿病患者死亡的主要原因之一。因此，对糖尿病肾病早期诊断及治疗方法的深入研究变得尤为重要。
经过本次与治疗DN药品相关的研究活动中，可以确定，当患有糖尿病的实验大鼠产生肾纤维化的问题之后，其多种蛋白表达会出现明显的增强效果，在大鼠提供的肾病模型内部，NF-κB、TLR4、TLR2对应的通路产生了过度活化的问题，而后其肾脏也因此出现了纤维化的变动，通过运用西格列汀药品，控制肾纤维化的问题，对患者患有的DN的进一步发展起到减缓的作用，充分改善患病大鼠的原有肾纤维化程度。借助本实验可了解到西格列汀药物在防治DN时能够发挥的重要效用，需围绕该药品，给这类患者形成合理用药方案。
糖尿病肾病患者存在蛋白尿与肾功能下降的临床反应，加强对该疾病的早期防治与有效治疗可降低拥有该类病症的患者的死亡率，西格列汀可对患者分泌胰岛素的情况实施改善，具体借助抑制异常糖代谢问题、炎症、氧化应激损伤与细胞凋亡等来实现，可强化糖尿病的预防效果。后续研究中还需继续分析其具体效用，形成科学治疗策略。
参考文献
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