摘要：目的 探讨HCV相关肝硬化患者外周血单核细胞亚型分布及临床意义。方法 选取2016.1-2017.5因丙肝肝硬化入住我院感染内科的34例患者为病例组，健康者18例为对照组。检测生化、血脂、血常规等基线资料。检测患者血清HCV-RNA载量并检测外周血单核细胞CD14、CD16的表达。结果 病例组ALT、AST、TG高于对照组，均有统计学意义（P＜0.05）；ALB、WBC计数、PLB计数病例组低于对照组，均有统计学意义（P＜0.05）；CD14++CD16-单核细胞亚群病例组高于对照组，有统计学意义（P＜0.01），CD14++CD16+单核细胞较对照组减少，有统计学意义（P＜0.01）。结论 单核细胞亚型在HCV相关肝硬化中有变化，其中CD14+ +CD16-和CD14++CD16+的单核细胞可能与HCV相关肝硬化的产生有关。
关键词: HCV；肝硬化；单核细胞；CD14；CD16
The Characteristics of Peripheral Blood Monocyte Subtypes in Patients with Hepatitis C virus-associated Cirrhosis
ZHANG yong-ping1▲, Li zhi-wei2, WEN qian1 (1 Department of Infectious Diseases, Xinjiang Autonomous Region People’s Hospital, Urumqi, 830000, China; 2 Xinjiang Autonomous Region People's rummage center, Urumqi, 830000, China )
Abstract Objective The study aimed at investigating the distribution of peripheral blood monocyte subtypes in patients with hepatitis C virus-associated cirrhosis, and researching its clinical significance. Methods In this study, the experimental group contained 34 patients with hepatitis C virus-associated cirrhosis and 18 healthy subjects were included in control group. Experimental group patients were recruited from infection department of Xinjiang Autonomous Region People’s Hospital (from January 2016 to May 2017). Biochemical index, blood lipids, blood routine and other baseline data were detected. Serum HCV RNA load was detected in experimental group. The expressions of peripheral blood mononuclear cell CD14, CD16 were detected by flow cytometry. Results The levels of ALT, AST and triglyceride in experimental group were higher than control group, which showed differences on statistics (P＜0.05). The levels of albumin, leucocyte count and platelet count in experiment group were lower than control group, which displayed significant differences on statistics (P＜0.05). Compared with control group, the level of CD14++CD16- was higher in experiment group (P＜0.01), the difference was not statistically significant; however, CD14++CD16+ were lower than control group, showing statistical significance (P＜0.01). Conclusion Monocyte subtypes changed in HCV - associated cirrhosis, in which CD14++CD16- monocytes and CD14++CD16+ monocytes may have effect on progress of HCV - associated cirrhosis.
Key Words: HCV; Cirrhosis; Monocytes; CD14; CD16
HCV（hepatitis C virus）相关肝硬化的预后仍然较差，每年丙肝肝硬化肝细胞癌的发病率是2％-4％[1]，每年HCV相关肝硬化的死亡率约为2％-5％[2]，对于HCV相关肝纤维化和肝硬化的发病机制至今仍不十分清楚，单核细胞是机体重要固有免疫细胞，近年来研究表明，单核细胞具有明显的异质性，根据其表面分子CD14、CD16表达水平可分为经典型(CD14++CD16-)、中间型（CD14++CD16+）和非经典型（CD14+CD16++）单核细胞亚群[3]。单核细胞亚群比例和功能异常和多种疾病密切相关，目前HCV相关肝硬化患者外周血单核细胞亚群的研究很少，本研究拟分析HCV相关肝硬化患者外周血单核细胞亚群分布特征，初步探讨单核细胞亚群在HCV相关肝硬化中的临床意义。
1 对象与方法
1.1研究对象
选取新疆维吾尔自治区人民医院2016年1月-2017年5月因丙型病毒性肝炎肝硬化患者入住感染内科的患者34例为病例组，诊断标准依据丙型肝炎防治指南（2015年版）[1]，入选患者均为Child分级A级患者，常规健康体检者18例为对照组。受试对象均排除①HAV、HBV、HDV、HEV和HIV重叠感染；②排除肝癌、酒精性及自身免疫性等其他肝病患者；③排除合并其他严重心、脑、肾、肺部疾患的患者。本研究经新疆自治区人民医院医学伦理委员会批准，所有研究对象均知情同意。并签署知情同意书。
1.2 研究方法
1.2.HCV RNA及常规生化及血常规指标检测
1.2.1 HCV RNA的检测：采用实时RT-PCR法检测，试剂盒购自Liferiver公司，货号Z-HR-0008-02EX，严格按说明书规范操作。
1.2.2常规生化及血常规指标检测：受试者晨起空腹采静脉血3mL并于2小时内完成血常规、生化常规ALT（Alanine transaminase，ALT）、AST（Aspartateamino transferase，AST）、白蛋白、球蛋白、甘油三酯（triglycerides，TG）和总胆固醇）等指标检测。采用贝克曼AV5800全自动生化分析仪检测。
1.3 单核细胞及亚群的流式细胞术检测
1.3.1 主要试剂与仪器
试剂：CD14-FITC（347493，生产批号：8086278），CD16-PE（347617，生产批号：5336699），IgG1-FITC（349041，生产批号：6078564），IgG1-PE（349043，生产批号：7205898），BD Cytometer Setup &Tracking Beads Kit（641319，生产批号：73159），BD FACS 7-Color Setup Beads（335775，生产批号：98657），FACS Lysing Solution溶血素（349202，生产批号：6256549），Falcon流式进样管，所有试剂和耗材均购自美国Becton, Dickinson and Company（BD）公司。仪器：美国 BD FACSCanto II流式细胞仪。离心机北京雷博尔LZD5-2，离心半径15.4 cm,离心力387.5 g。
1.3.2标本处理
使用EDTA-K2抗凝管采集患者1 mL的外周血。取两支Falcon流式进样管，各加入50 μL抗凝全血。第一管中加入IgG1-FITC和IgG1-PE各20 μL，第二管中加入CD14-FITC 和CD16-PE 各20 μL。震荡混匀后，避光孵育20 min。加入2 mL溶血素，混匀后放置10 min。1500转离心5 min后弃上清，再加入2 mL PBS洗涤，离心弃上清后加入500 μL PBS待上机检测。抗体均购置BD公司。
1.3.3 上机检测
每次检测前使用BD Cytometer Setup &Tracking Beads Kit进行质控，必要时调整机器电压和补偿。将制备好样本使用FACS Diva 6.0进行数据的采集和分析，每管收集5万个细胞。每个标本使用FSC和SSC进行设门，选取单核细胞群，使用IgG1作为阴性对照，根据CD16和CD14不同表达强度确定单核细胞亚群，最后分析CD14++CD16-、CD14++CD16+和CD14+CD16++亚群占单核细胞的百分比，分析流程如图1所示。
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图1 单核细胞及其亚群的流式细胞检测
注：P1门：单核细胞群；P2门:CD14++CD16-亚群；P3门:CD14++CD16+亚群；P4门:CD14+CD16++亚群。
1.4 统计学分析
采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，患者的年龄、生化指标HCV - RNA载量，单核细胞各组亚群等计量资料呈正态分布，以x ± s表示，两组资料比较采用独立样本t检验及两-两相关分析，ɑ = 0.05，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1病例组与对照组患者基本临床资料
病例组34例，其中男性18例，女性16例，维吾尔族19例，汉族9例，哈萨克族4例，回族2例，平均年龄：53.82±12.211岁，HCV RNA载量：5.91±1.83log10 IU/mL（2.7-8.0）。对照组18例，男性例，女性例，平均年龄38.72±14.05岁。两组指标比较ALT、AST、TG有统计学差异，均高于对照组（P < 0.05），白蛋白、白细胞和血小板两组比较均低于对照组，有统计学差异（P < 0.05）（结果详见表1）。
表1 两组生化指标、血脂、白细胞计数及血小板计数比较
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2.2 病例组与对照组CD14、CD16单核细胞表达情况
白细胞计数病例组高于对照组差异有统计学意义（P＜0.05）CD14++CD16-单核细胞亚群病例组较对照组增多，差异有统计学意义（P＜0.01），CD14++CD16+单核细胞较对照组减少，差异有统计学意义（P ＜0.01），CD14+CD16++较对照组增多，差异无统计学意义（P ＞0.05）（详见表2）。
表2 两组CD14++CD16-、CD14++CD16+和CD14+CD16++单核细胞亚群分布
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2.3 单核细胞亚型与HCV-RNA载量、生化指标及血小板的相关性分析
表3 单核细胞亚型与HCV-RNA载量、生化指标及血小板的相关性分析
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3 讨论
本实验中34例HCV相关肝硬化患者相对于对照组，单核细胞计数无差异的情况下，HCV相关肝硬化患者，CD14++CD16-经典型的单核细胞计数增多的，CD14++CD16+中间型单核细胞减少，其差异有统计学意义，CD14+CD16++非典型单核细胞较对照组无统计学差异。CD14 是脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）受体，主要介导固有免疫应答[4]，在本研究中可能在HCV感染过程中，CD14++CD16-的单核细胞为发挥其重要的免疫防御作用反应性的增加，也有相关研究支持本研究结果，比如在动脉粥样硬化、腹膜炎、尿路感染及肝脏损伤时，小鼠Ly6Chi单核细胞（相当于人的CD14++CD16-经典型的单核细胞）快速募集至损伤组织[5-8]，并且在受损的组织处发现Ly6Chi单核细胞转化为具有促炎作用的巨噬细胞和产生TNF（Tumor necrosis factor，TNF）的树突状细胞[5, 9, 10]。
目前较多文献报道与本研究结果不一致，CD14++CD16+、CD14+CD16++的中间型和非典型的单核细胞，也称为CD16+的单核细胞，CD16也被称作FcγRc，结合IgG的Fc段，发挥调理作用和抗体依赖的细胞介导的细胞毒（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）作用[11-13]。CD14++CD16-、CD14++CD16+与CD14+CD16++是单核细胞逐渐分化成熟的过程[4]。因此CD16+表达的单核细胞较CD16-的单核细胞释放更多的促炎因子，CD14++CD16+单核细胞同时表达大量CX3CR1和CCR2[14]，持续募集和促进肝组织CD14++CD16-单核细胞的分化，造成肝局部CD14++CD16+单核细胞的增加，CD14++CD16+单核细胞分泌大量炎性因子[6]。并且可以直接活化星状细胞促进肝纤维化发生[15]。这些研究结果与本研究不同，再次分析本次研究选择的病例组ALT、AST、白蛋白、甘油三脂、白细胞计数及血小板与对照组相比较，均有统计学差异，符合临床丙肝相关型肝硬化的临床特点。有研究报道外周血在肝损伤因子刺激下，进入肝组织，转化为CD14++CD16+中间型单核细胞，分泌炎症因子及趋化因子[14]，刺激机体产生并招募更多的CD14++CD16-单核细胞肝组织参与肝脏炎症及纤维化的进展[6, 15]。也能够解释本次研究结果：外周血CD14++CD16-单核细胞在HCV的刺激下数量增加，进入肝组织转化为转化为参与炎症及肝纤维化过程[5]。
本研究中最显著的问题是外周血中CD14++CD16-单核细胞的增加伴随CD14++CD16+中间型单核细胞在减少，这与目前部分文献报道不同[14]，分析其原因之一可能CD14++CD16-的单核细胞虽然数量增加，不能向更成熟CD14+CD16+的单核细胞转化，这与HCV密切相关，HCV感染后的单核细胞在多种病毒蛋白如HCV core蛋白、 NS3A重组蛋白、HCV 结构蛋白 E2 以及非结构蛋白 NS5A等，产生负性免疫调节[16-20]。原因之二可能与HCV对单核细胞固有免疫的损伤有关，表现为免疫耐受和免疫逃逸[17, 21, 22]，表现为CD14++CD16-的单核细胞的数量增加，仍不能转化为更成熟的CD14++CD16+中间型单核细胞和CD14++CD16++非经典的单核细胞，从而有效清除HCV。原因三可能与HCV及其相关蛋白改变了单核细胞 TLR（Toll-likereceptor，TLR） 反应以及单核细胞异常炎症因子表达，导致不能产生足够的免疫反应对抗HCV[20, 23]。由于人类的肝组织很难获取，很多研究基于动物模型研究：伴随着肝组织的损伤，外周血中CD14++CD16-的单核细胞在数量上反应性的增加，并进入组织中分化进一步分化为CD14++CD16+、CD14++CD16++单核细胞[20, 24]，在外周血中难以检测到CD14++CD16+、CD14++CD16++单核细胞。有报道CD14+CD16-的单核细胞更倾向于组织的修复[4, 25]，HCV相关的肝脏的纤维化其本质就是长期持续的HCV难以清除及肝脏枯否氏细胞、HSC等细胞不断修复炎症损伤造成的不良结局[22]。因此可能在肝纤维化/硬化不同的时期CD16-和CD16+的单核细胞呈现动态变化。
对于HCV相关的慢性肝脏炎症及纤维化，目前其发生机制仍不十分清楚，与机体多种免疫细胞功能变化关系密切[26]，外周血的单核细胞作为重要固有免疫细胞，是肝组织中枯否氏细胞的主要来源于，在向肝组织迁入及分化中与肝脏的炎症、纤维化和/或硬化、甚至肝细胞癌的发生可能扮演着重要的角色，鉴于单核细胞的可塑性，深入的研究可能会成为未来肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌生物治疗的重要靶点。
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