摘要：亚硝酸盐是致癌物质，检测食品中的亚硝酸盐，对食品安全的意义尤为重要。其中乳及其乳制品的检测方法，目前主要以GB 5009.33的检测方法为主，其中第二法分光光度法术以使用广泛，但国标法中分光光度法测定亚硝酸盐存在取样量大，批量操作过程复杂情况。本课题主要针对以上问题，用分光光度法对生鲜乳及乳粉中的亚硝酸盐含量测定过程进行优化。优化后，样品取样量生鲜乳为18mL,奶粉为2g，加标回收实验回收率达到88%以上；RSD值为1.06%~1.93%，与国标法回收率90%；RSD值为0.66%~1.44%。从回收率及RSD可以得出，优化后的方法数据准确度与国标法相当。操作过程中使用高速离心机，能更好分离提取溶液，能很好的提升工作效率并保证实验的准确性，具有较好的操作性。
关键词：亚硝酸盐；分光光度法；乳制品
1.引言
亚硝酸盐是自然界环境中最普遍存在的含氮化合物之一[1]，是自然界常见的有害化学成分。因其具有作为发色剂、防腐剂以及增强产品的风味的作用而被添加到食品中来。
牛奶及其制品因其中含有丰富而全面的营养物质，中国居民膳食指南推荐每日摄入300g及以上牛奶或其制品，是人们日常生活中重要的日常食品。事实上天然牛奶中一般不含或含极有少量的亚硝酸盐，一般不会危害人体健康。牛奶中出现较高的亚硝酸盐可能的来源主要有：来源一是草料在喂养奶牛后，在其消化系统消化过程中产生，来源二是在饲喂过程产生，来源三是生产用水中存在，来源四是为了延长牛奶的保质期人为添加[2] 。由于亚硝酸盐对人体健康有如此严重的危害，而牛奶及其奶制品与我们生活息息相关，因此，检测其在乳及乳制品中的含量和可能被人体摄入量应引起高度重视。
目前国内外测定食品中亚硝酸盐含量的方法主要有荧光法、分光光度计法、离子色谱法及催化光度法等。分光光度法由于实用性强，设备常用，因此为国内外测定食品中亚硝酸盐时常见选择的方法[3]。但是目前国标法中的分光光度法实验存在样品使用量大、试剂消耗大、大量样品操作不灵活、同时沉淀后过滤难等问题。为了减少样品跟试剂的使用以及提高实验的效率，本实验对国标法的操作进行了适当的调整优化。
2.材料与方法
2.1实验方法
国家标准GB 5009.33-2016第二法中的分光光度法测定样品的亚硝酸盐的实验原理是样品中加入乙酸锌溶液以除去蛋白质及脂肪。此时在弱酸环境下,对氨基苯磺酸会与亚硝酸盐发生重氮化,得到的产物再与盐酸萘乙二胺偶合反应形成紫红色的特殊染料,在特定波长下，会呈现线性关系。基于相同的实验原理情况下，参照卞玲娟等[4]对实验的改进进行修改的实验分析，对方法进行优化，减少取样量，便于大批量样品的前处理，在沸水浴摇床上进行震摇能有效促进样品与饱和硼砂溶液的混合。在沉淀蛋白和脂肪的操作中使用高速离心机，更有效地分离和沉淀，更方便之后的过滤操作。
本次优化实验主要以鲜牛乳及奶粉作为实验对象，进行加标回收实验，验证方法的可行性。同时按照国标法实验方法操作，作为对比实验。
2.2试剂配制
亚硝酸钠标准使用溶液（5.0μg/mL）：吸取2.50mL亚硝酸钠标准物质（200μg/mL）于100mL容量瓶中，定容，摇匀。
亚铁氰化钾溶液(106g/L)：在电子天平上称106.0g亚铁氰化钾于小烧杯中,加去离子水溶解,稀释至1000mL。
乙酸锌溶液(220g/L)：在电子天平上称220.0g乙酸锌于烧杯中,加入30mL冰乙酸进行溶解,加去离子水稀释至1000mL。
饱和硼砂溶液(50g/L)：在电子天平上称5.0g硼酸钠试剂,用100mL热水进行溶解,冷却后备用。
盐酸萘乙二胺溶液(2g/L)：在万分之一电子天平上准确称取0.2g盐酸萘乙二胺,加入去离子水定容到100mL,混匀后置于棕色瓶中进行避光低温保存。
盐酸(20%):用量筒小心量取20mL盐酸,加入去离子水稀释至100mL。
对氨基苯磺酸溶液(4g/L)：在万分之一电子天平上准确称取0.4g对氨基苯磺酸,加入浓度为20%盐酸定容到100mL,小心混匀后置于棕色瓶中避光低温保存。
2.3仪器与设备
UV1800型可见光分光光度计（日本岛津公司），分析天平，SIGMA离心机
2.4计算公式
亚硝酸盐(以亚硝酸钠计)的含量计算:
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X1代表测试样品中亚硝酸钠的含量,单位为毫克每千克(mg/kg);
V1代表测定用样液体积,单位为毫升(mL);
V2代表试样处理液总体积,单位为毫升(mL)；
m2代表测定用样液中亚硝酸钠的质量,单位为微克(μg);
m3代表试样质量,单位为克(g);
1000代表转换系数
3.实验步骤
3.1优化方法的加标回收实验
3.1.1样品前处理
生鲜乳样品：取10支50mL离心管，用移液管往离心管准确取试样18mL样品，并用万分之一天平称重。分别加标0.0ug/mL、0.1ug/mL、0.2ug/mL、0.3ug/mL、0.4ug/mL各两支，做好标记，各加2.5mL50g/L饱和硼砂溶液，加入70℃左右的去离子水12mL，混匀。
乳粉：取10支50mL离心管，万分之一天平称取试样2g(精确至0.001g)，分别加标0.0ug/mL、0.9ug/mL、1.8ug/mL、2.7ug/mL、3.6ug/mL各两支，做好标记。往各离心管加2.5mL50g/L饱和硼砂溶液，加入70℃左右的去离子水30mL，混匀。
将上述离心管，放于摇床沸水浴加热震摇15分钟，取出置冷水浴中冷却至室温。再向离心管中加入1mL106g/L亚铁氰化钾溶液，置于振荡器中振匀，再加入1mL220g/L乙酸锌溶液并加水定容到40mL，振荡器振匀，放置30分钟后以25摄氏度，转速r9000离心3分钟。上清液用滤纸过滤，弃去少量初始滤液后，收集剩余滤液备用。
3.1.2测定
取8支10mL带塞比色分别加入0.000、0.015、0.030、0.060、0.090、0.120、0.150、0.180mL亚硝酸钠标准使用液，另吸取4mL上述样品滤液于10mL带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入0.6mL4g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀后静置5min后，分别加入0.3mL2g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min。用1cm 比色杯，以零管调节零点，于波长538nm 处测吸光度，绘制标准曲线。同时做试剂空白。
3.2对照实验
3.2.1国标法样品的前处理
生鲜乳样品：取10个250mL具塞锥形瓶，用天平称取生鲜乳90g(精确至0.001g),置于250mL具塞锥形瓶中，分别加标0.0ug/mL、0.1ug/mL、0.2ug/mL、0.3ug/mL、0.4 ug/mL各两支，做好标记。分别往具塞锥形瓶中加入12.5mL饱和硼砂溶液，然后加入70℃左右的水约60mL，摇匀。
乳粉：取10支150mL具塞锥形瓶，各称取乳粉样品10g(精确至0.001g),置于瓶中。分别加标0.0ug/mL、0.9ug/mL、1.8ug/mL、2.7ug/mL、3.6ug/mL各两支，做好标记。各加入12.5mL饱和硼砂溶液,加入70℃左右的水150mL，混匀。
将上述锥形瓶于沸水浴中反应15分钟,取出置冷水浴中冷却,并放置至室温。定量转移上述提取液至200mL容量瓶中,加入5mL106g/L亚铁氰化钾溶液,摇匀,再加入5mL220g/L乙酸锌溶液,以沉淀蛋白质。加水至刻度,摇匀,放置30min,除去上层脂肪,上清液用滤纸过滤,滤液备用。
3.2.2国标法的测定
吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL亚硝酸钠标准使用液,分别置于50mL带塞比色管中，另吸取40.0mL上述滤液于相同规格比色管中。于标准管与试样管中分别加入2mL4g/L对氨基苯磺酸溶液,混匀,静置3min~5min后各加入1mL2g/L盐酸萘乙二胺溶液,加水至刻度,混匀,静置15min,用1cm比色杯,以零管调节零点,于波长538nm处 测吸光度,绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。[5]
4.结果分析
按照优化后的方法和国标方法进行对比，先取得足量生鲜乳样品，各分成五份，一份样品直接按测试方法进行测定分析，另外四份分别加标0.1、0.2、0.3、0.4ug/mL，每份样品都进行6组平行测试，测定的结果见表1和表2。
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由表1可以看到，经过优化后的试验方法在测定生鲜乳的加标回收率在88%~93%之间，相对标准偏差在1.19%~1.82%之间。
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由表2中可以看出，国标方法对生鲜乳测定的回收率在90.5%~95%之间，相对标准偏差在0.66%~1.33%之间。
按照优化后的方法和国标方法进行试验比较，取足量奶粉样品，各分成五份，一份直接测试样品含量，另外四份分别加标0.9、1.8、2.7、3.6ug/mL，每一份样品都进行6组平行测试，测定的结果见表3和表4。
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由表3可见，优化后的测试方法在测定奶粉样品的加标回收率在88.5%~95%之间，相对标准偏差在1.06%~1.93%之间。
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表4是根据国标法对奶粉样品进行加标回收测试，可以看出国标方法在测定奶粉的回收率在90.25%~94%之间，其相对标准偏差在1.08~1.44之间。
综合表1以及表2的回收率发现，国标方法测得的回收率结果比优化后的方法的结果略高一些，而从两者的RSD值看，国标法RSD值0.66%~1.33%也比优化后的方法的RSD值1.19%~1.82%小一些，但差别不大。而从表2、表3来看，两种方法对奶粉的测定也有跟生鲜乳测试类似的结果。说明国标法比优化后方法测得的结果相对更优一些，从相对平均偏差来看也是国标法精密度更高一些，稳定性更好一些。这其中原因可能是，经过优化的试验方法，其取样量比国标方法小很多，相对的样品结果出现的误差也会增大，样品加标后，在处理过程中的损失也相对大一些。另外，从四个表中的数据看，随着加标量的增加回收率有一个轻微下降的趋势，可能的原因，一个是亚硝酸盐相对不稳定，加标量越多，损失越大，另外，由于随着加标量的递加，饱和硼砂溶液的添加量却没增加导致的，饱和硼砂溶液在实验中是助提剂，可能会存在影响，后续可进行进一步的实验研究。
依据没加标的样品实验结果看，生鲜乳样品的亚硝酸盐含量非常低，比国标的限量值低得多，而从肖琴等[6]的实验结果看，正常生鲜乳得亚硝酸盐在0.0314~0.1069mg/kg左右，远低于国标的限制值。因此，用优化后的实验方法替代国标法进行实验有助于提高工作效率，减少试剂的使用，其实验结果与国家标准方法的检测结果的回收率和精密度并无太大差异。而奶粉的实验结果也是同样道理
5.结论
优化后的实验，生鲜乳取样量仅18mL，乳粉取样量仅2g，试剂的使用仅为国标法的1/5，同时在实验过程中省去一步样品容器之间的转移过程，这样的转移步骤的减少可以减少亚硝酸盐的损失，增加实验的准确性。在去除样品中的蛋白脂肪过程中，通过离心可以使蛋白质等沉淀，脂肪上浮，能快速得到澄清样液，可以大幅提高过滤效率，在处理大量样品量时有更大得效率提升。在提高了工作效率，减少试剂用量的同时，优化后的方法的检测结果与国标法检测结果回收率基本相同，其精密度也差别不大，证明该方法实用可靠。后续可通过继续增加实验进一步验证其方法的精密度及检出限，或者拓宽检测范围，对其他产品进行验证。
参考文献：
[1].丁晓雯,柳春红.食品安全学.北京:中国农业出版社,2011.
[2].赵佳,董永,马晓杰,等.我国29省、市、自治区市售纯牛奶亚硝酸盐含量普查[J].中国奶牛.2011，12.55-58
[3].陈永平,林黎明,宫庆礼,等.亚硝酸盐和硝酸盐检测方法的研究进展[J].分析试验室,2008,27(S):193-198.
[4].卞玲娟，何浩.改进分光光度法测定食品中的亚硝酸盐含量[J].食品安全质量检测学报.2017,8(4):1491-1492
[5].GB5009.33—2016.食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定[S].2016
[6].肖琴,麦淑文,巫慧妮,等.分光光度法测定纯牛奶中亚硝酸盐含量的研究[J].粮油食品科技.2013,21(5):81-83
作者简介：利志锋（1989-05），男，汉族，籍贯：广东省广州市，当前职务：检验员，当前职称：助理工程师，学历：本科