摘要：目的 建立反相高效液相色谱法分离测定盐酸氨溴索及其有关物质。方法 采用十八烷基硅烷键合硅胶柱（250 mm×4.6 mm,5μm）为色谱柱,流动相为0.01mol ·L-1 磷酸氢二铵溶液(用磷酸调pH值至7.0) -乙腈(50:50) ，流速为1mol ·L-1 ，检测波长为250nm和238nm。结果 盐酸氨溴索与各已知杂质及强制破坏产生的降解产物均分离良好;盐酸氨溴索、杂质A、B、C、D、E在各自的线性范围内质量浓度与峰面积呈良好的线性关系 , 上述杂质的平均回收率（n=9）分别为96.9%、97.0%、100.6%、98.3%、92.1% , RSD（n=6）分别为1.5%、1.6%、0.7%、1.2%、1.4% 。结论 该方法测定盐酸氨溴索注射液中的有关物质方法灵敏、准确、专属性强 。
关键词：高效液相色谱法；盐酸氨溴索注射液；有关物质测定。
Determination of related substances in
ambroxol hydrochloride injection by HPLC
Abstract :Objective To develop an HPLC method for the separation of ambroxol hydroch-loride and determination of its known related substances. Method The analysis was condu-cted on a Octadecyl bonded silica column（250 mm × 4.6 mm,5 μm was adopted . The mobile phase was 1mol·L-1 diammonium phosphate(adjusted the pH to7.0 with phosphate)-acetonitrile(50∶50) ，the flow rate was 1ml/min，the detection wave length was 250nm and 238nm．Results The known impurities and degraded products by forced destruction we-re completely separated from Ambroxol hydrochloride. Ambroxol hydrochloride,impurity A,B,C,D,E showed good linearity ，respectively，the average recovery rates was 98.6%，97.8%，99.7% and 100.8%，and the RSDs were 1.6%，2.5%，1.8% and 2.8% ( n= 9) .
Conclusion: The method is sensitive, accurate and specific，and can be used to determine the related substances in Ambroxol hydrochloride．
Key words: HPLC ；Ambroxol Hydrochloride Injection; related substances .
盐酸氨溴索( Ambroxol hydrochloride)是一种临床上使用已久的黏痰溶解药，在增加痰量降低痰液黏度止咳祛痰等方面具有很好的临床疗效[1,2] ，可使肺表面活性物质和呼吸道黏液的分泌得到促进纤毛运动得到改善痰液排出能够顺利[3] ，适用于术后肺部并发症的预防性的治疗，新生儿的婴儿呼吸窘迫症( IRDS) 的治疗。《中国药典》针对盐酸氨溴索的有关物质测定方法中，反式- 4-[6,8-二溴- 1,4-二氢喹唑啉-3(2H)]环己醇仅作为系统适用性试验中要求，本试验对该品种的药物的杂质重新进行了研究，本研究采用高效液相色谱（HPLC）技术建立盐酸氨溴索注射液的有关物质质量控制研究提供参考，该方法快速、准确、重现性好、灵敏度高，可用于盐酸氨溴索注射液的质量控制 。
1 仪器与试药
安捷伦1260 G4212B型DAD检测器；十万分之一电子分析天平（梅特勒公司）。
盐酸氨溴索注射液，规格为100ml:盐酸氨溴索30mg与氯化钠0.9g，批号1906242102;
辰欣药业股份有限公司，
杂质A（2-氨基-3,5-二溴苯甲醇），
杂质B（反式-4-(6,8-二溴-四氢喹唑啉环己醇），
杂质C（反式-4-(6,8-二溴-四氢喹唑啉环己醇，
杂质D (顺式-4-[(2-氨基-3,5-二溴苯基)氨基]环己醇)
杂质E (2-氨基-3,5-二溴苯甲醛)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
仪器：安捷伦1260 G4212B型DAD检测器
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相：0.01mol/L磷酸氢二铵溶液(用磷酸调节pH值至7.0)-乙腈(50:50)；
流速：1ml/min；
检测波长：250nm和238nm ；进样量：50μl；
稀释剂：流动相和水
2.2 系统适应性试验
取上述各定位溶液、混合对照品溶液、空白辅料溶液、稀释剂、水各50ul注入液相色谱仪，甲醇、水、空白辅料溶液不干扰样品中杂质的检测，各杂质及与主成分之间分离度良好。
2.3 有关物质测定方法
取本品，加水稀释制成每1ml中约含盐酸氨溴索0.15mg的溶液，作为供试品溶液；精密称取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和杂质E对照品各15mg，分别置50ml 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取上述溶液适量，用流动相稀释制成每1ml含盐酸氨溴索、杂质B及杂质E均为0.3μg，杂质A、杂质C及杂质D均为0.15μg的溶液，作为对照品溶液（临用新制）。在250nm波长处检测杂质A、B、D，在238nm波长处检测杂质C和E，各杂质峰的分离度均应符合要求。精密量取对照品溶液50l，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使盐酸氨溴索峰的峰高为满量程的10%~25%，再精密量取对照品溶液和供试品溶液各50l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的4倍。结果：甲醇、水、空白辅料溶液不干扰样品中杂质的检测，各杂质及与主成分之间分离度良好。结果见图1。
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图1 盐酸氨溴索注射液有关物质对照溶液HPLC色谱图
2.4 专属性试验
为验证本方法对相关降解产物的专属性，对盐酸氨溴索注射液分别进行强酸、强碱、高温和强光降解试验。酸降解试验：精密量取本品5ml，置20ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液3ml，置100℃水浴中加热20min，冷却至室温，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至6.0，用水稀释至刻度，摇匀，即得 。碱降解试验：精密量取本品5ml，置20ml量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠溶液3ml，100℃水浴中放置20min，用0.1mol/L的盐酸溶液调节pH至6.0，用水稀释至刻度，摇匀，即得。氧化降解试验：精密量取本品5ml，置20ml量瓶中，加30%过氧化氢溶液0.5ml，摇匀，室温放置20min，冷至室温，加水稀释至刻度，摇匀，即得。高温降解试验：取本品5ml，置20ml量瓶中，置水浴中放置3小时，放冷至室温，加水稀释至刻度，摇匀，即得。光降解试验：取本品，置光照箱中5000Lx照射20天后，在放置日光下照射2小时，精密量取5ml，置20ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
精密量取上述溶液各100μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的4倍，主峰与相邻杂质的分离度均达到要求，表明本方法专属性良好，能用于本品有关物质检测。
2.5 线性关系试验
精密量取专属性项下对照品贮备液各2ml，置同一20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml，分别置5个10ml量瓶中，均用流动相稀释至刻度，摇匀，分别作为待测溶液。分别精密吸取上述溶液及定量限溶液各50μl，注入色谱仪，记录色谱图。
杂质A求得线性回归方程为A=102.5C+0.0758，R=0.9999,在0.02μg/ml～0.59μg/ml范围内，杂质A浓度均与峰面积呈良好的线性关系。
杂质B求得线性回归方程为A=56.461C+0.5887，R=0.9997,在0.04μg/ml～0.61μg/ml范围内，杂质B浓度均与峰面积呈良好的线性关系。
杂质C线性回归方程为A=156.43C+1.2172，R=0.9999,在0.04μg/ml～0.58μg/ml范围内，杂质C浓度均与峰面积呈良好的线性关系。
杂质D线性回归方程为A=61.492C+0.0507，R=0.9995,在0.05μg/ml～0.59μg/ml范围内，杂质D浓度均与峰面积呈良好的线性关系。
杂质E线性回归方程为A=297.05C+0.4027，R=0.9999,在0.01μg/ml～0.65μg/ml范围内，杂质E浓度均与峰面积呈良好的线性关系。
盐酸氨溴索求得线性回归方程为A=70.897C+0.4863，R=0.9997，在0.04μg/ml～0.61μg/ml范围内，盐酸氨溴索浓度均与峰面积呈良好的线性关系。
2.6 定量限试验
取专属性项下各对照品定位溶液，根据定位试验的信噪比，逐步稀释，直至信噪比(S/N)约为10对应的浓度为该杂质的定量限，平行进样6次，结果盐酸氨溴索、杂质A、B、C、D、E的定量限分别是1.9ng,0.9ng,1.9ng，1.8ng,2.6ng,0.7ng。
2.7 检测限试验
取定量限溶液，逐步稀释，依法测定，精密吸取50μl注入液相色谱仪，结果盐酸氨溴索、杂质A、B、C、D、E的检测限分别是0.6ng,0.3ng,0.6ng，0.5ng,0.8ng,0.2ng。
2.8 溶液稳定性
①供试品溶液的稳定性
取本品，作为供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、8、10、12小时，取样测定，试验结果表明，有关物质检查测定液，在室温条件下放置，12h内样品中杂质峰面积及保留时间均未发生明显变化。
②对照品溶液的稳定性
精密称取杂质A、C、D对照品各7.5mg和B、E各15mg，置50ml量瓶中加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品溶液。室温放置，分别于0、2、4、6、8、10、12小时，试验结果表明，各杂质对照品溶液在室温条件下放置，根据其12h内峰面积变化趋势，杂质A、B、D在12小时内稳定，但是杂质C和E在12小时内稍微降解，因此对照品溶液需要临用新制。各杂质的保留时间均未发生明显变化。
2.9 精密度
供试品溶液：取本品（规格100ml：15mg）6份，作为供试品溶液1。
取本品（规格100ml：30mg）5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液2，平行配制6份。
对照品溶液：精密量取上述A、C、D对照品贮备液各0.5ml和B、E盐酸氨溴索的对照品贮备液各1ml，置同一50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液，即得，重复配制6份，杂质A、B、E、未知杂质、总杂的含量平均值为0.014%,0.024%，0.008%,0.034%,0.12%，杂质C、D未检出；对照溶液RSD 为0.5%,1.4%,1.8%,0.6%,1.2%,0.4%，试验结果表明，有关物质检查供试品溶液、对照品溶液进样重复性良好。
2.10准确度
精密称取杂质A、B、C、D、E对照品各7.5mg，分别置25ml量瓶中加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取A、C、D各2.5ml和分别精密量取B、E5ml，置同一50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置同一20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品储备液。
精密量取对照品储备液2ml和精密量取专属性盐酸氨溴索贮备液0.2ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
供试品溶液（规格：100ml:盐酸氨溴索30mg与氯化钠0.9g）：取本品5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
规格为100ml:盐酸氨溴索30mg与氯化钠0.9g的回收率溶液：精密量取对照品储备液2ml，置10ml量瓶中，加本品5ml，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为100%浓度供试品溶液；同法配制同法配制80%和120%供试品溶液，每个浓度配制3份。杂质A、B、C、D、E的回收率分别为96.9%、97.0%、100.6%、98.3%、92.1% , RSD（n=6）分别为1.5%、1.6%、0.7%、1.2%、1.4% 。
2.11耐用性试验
对有关物质分析方法进行了耐用性试验，研究内容包括：改变流动相组成（±2），改变流动相pH（±0.2），改变色谱柱品牌， 改变柱温（±5℃）和改变流速（±0.2ml/min），比较不同条件下同一批样品杂质含量的测定结果，标准条件参见稳定性考察0h数据，结果不同条件下供试品的测定结果基本一致，表明色谱条件在一定范围内是耐用的。
3 讨论
通过查阅参考文献，并经过严格的实验验证，采用HPLC法测定盐酸氨溴索的有关物质的方法，能够有效分离、检验盐酸氨溴索的有关物质，专属性强、准确度高，操作简便、准确，可用于该品种的质量控制。
参考文献
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