【摘要】目的:探讨Nkx2.1/β-catenin信号通路在前肠分化发育过程的作用机制。方法：购置SGC-7901食管上皮细胞系，随机分为对照组和观察组。对照组采用DMSO处理，观察组采用特异性抑制剂MLN8237进行处理，浓度为20umol/L，采用Westernblotting法测定Nkx2.1/β-catenin信号通路关键蛋白、EMT相关蛋白表达水平；采用MTT法完成两组食管上皮细胞增殖情况；采用Transwell法测定两组细胞侵袭情况。结果：Westernblotting法测定结果表明：观察组食管上皮细胞中N-cadherin、E-cadherin、GAPDH蛋白水平低于对照组（P<0.05）；两组0h细胞增殖抑制率比较无统计学意义（P>0.05）；观察组干预后6h、12h、24h细胞增殖抑制率高于对照组（P<0.05）；Transwell法测定结果表明：观察组细胞培养24h后细胞穿过基膜的细胞数量为（28.45±5.41）个低于对照组（82.59±8.94）个（P<0.05）。结论：通过调控Nkx2.1/β-catenin信号通路等影响食管上皮细胞的侵袭、增殖，能为前肠发育畸形的治疗提供新的方向。
【关键词】Nkx2.1/β-catenin；信号通路；食管上皮细胞；增殖与侵袭；前肠分化发育
The mechanism of Nkx2.1 / β-catenin signaling pathway in the foregut differentiation and development
【Abstract】 Objective: To explore the mechanism of Nkx2.1 / β-catenin signaling pathway in the process of foregut differentiation and development. Methods: SGC-7901 esophageal epithelial cell line was purchased and randomly divided into a control group and an observation group. The control group was treated with DMSO, and the observation group was treated with a specific inhibitor MLN8237 at a concentration of 20umol / L. Westernblotting method was used to determine the expression levels of Nkx2.1 / β-catenin signaling pathway key proteins and EMT-related proteins; MTT method was used to complete the two Proliferation of esophageal epithelial cells in the group; Transwell method was used to measure cell invasion in the two groups. Results: The results of Westernblotting method showed that the levels of N-cadherin, E-cadherin and GAPDH protein in the esophageal epithelial cells of the observation group were lower than those of the control group (P <0.05); the 0h cell proliferation inhibition rate of the two groups was not statistically significant (P> 0.05); the inhibition rate of cell proliferation at 6h, 12h, and 24h after intervention in the observation group was higher than that in the control group (P <0.05); the results of Transwell method showed that the number of cells that passed through the basement membrane in the observation group after cultured for 24h was (28.45 ± 5.41) were lower than the control group (82.59 ± 8.94) (P <0.05). Conclusion: By regulating the Nkx2.1 / β-catenin signaling pathway and affecting the invasion and proliferation of esophageal epithelial cells, it can provide a new direction for the treatment of anterior bowel developmental malformations.
[Keywords] Nkx2.1 / β-catenin; signaling pathway; esophageal epithelial cells; proliferation and invasion; foregut differentiation and development
发育生物学已证实前肠与多种器官的分化发育有关。目前，最常见的前肠发育畸形是食道闭锁合并食管气管瘘（esophageal atresia, EA/tracheo- esophageal fistula, TEF）。已有文献报道：前肠发育畸形发病率大约为1/4099。随着外科医疗水平的提高，大部分前肠发育畸形患儿可以通过手术成功校正，但往往有严重的术后并发症。因此研究前肠分化发育，阐明其生理机制，可以有助于临床实际工作中的预防、诊断以及治疗[1]。因此，本研究以SGC-7901食管上皮细胞系作为对象，探讨Nkx2.1/β-catenin信号通路在前肠分化发育过程的作用机制，报道如下。
1.资料与方法
1.1细胞资料
2018年6月-2019年7月购置SGC-7901食管上皮细胞系，随机分为对照组和观察组，所有细胞均购置于中国科学院上海生命科学院研究院。将购置的细胞放置在10.0%DMEM培养基中（含有胎牛血清），%CO2中进行连续培养，培养温37℃。
1.2仪器与设备
小分子抑制剂MLN8237（美国Selleckchem公司）、实时荧光PCR试剂盒（美国Promega公司）、Trizol试剂（美国Invitrogen公司）、酶标仪（美国Tec公司）、低温高速离心机（Thermo公司）、CO2恒温培养箱（上海三腾仪器）。
1.3方法
（1）细胞分组及干预方法。购置SGC-7901食管上皮细胞系，随机分为对照组和观察组。对照组细胞采用DMSO进行处理，浓度为0.1%；观察组采用MLN8237溶解液进行处理（将MLN8237溶解于DMSO中，调整溶液最终浓度20mmol/，备用），使得药物最终浓度为20umol/L，两组均完成24h处理、培养；（2）检测方法。①Nkx2.1/β-catenin表达水平。1、RNA的分离、提取。取上述分离的细胞标本，向标本中加入Trizol500uL，充分混合后转移到离心管1.0mL，5min振荡后，静置。向两组血清标本中加入氯仿200uL15s振荡，5min静置后15min离心，离心力1216。去除上层清液，加入预冷的乙醇（浓度75.0%）1mL，常温下7min干燥；经紫外分光度仪A260下测定吸光度值。2、检测方法。采用实时荧光PCR技术完成两种细胞中Nkx2.1/β-catenin表达水平。
设置PCR参数：30℃下10min；42℃下30min；99℃下5min；5℃下5min，连续进行35个循环，72℃下10min延长，获得最终产物并放入1.5%琼脂凝胶电泳，β-actin为内对照。②Nkx2.1信号通路关键蛋白、EMT相关蛋白表达。采用Westernblotting法测定Nkx2.1信号通路关键蛋白、EMT相关蛋白表达水平。取两组处理后的细胞，并向细胞中加入少许RIPA试剂完成蛋白的提取，并根据BCA试剂盒测定提取蛋白量；向每孔中加强样本量20ug，采用SDS-PAGE法完成蛋白的分离并将其转移到PVDF膜上。以浓度为5%Tris-HCL作为缓冲液，1h封闭，分别加入一定量的兔抗人Nkx2.1/β-catenin多克隆抗体，4℃下孵育过夜，采用PBST连续进行3次洗膜，加入化学发光试剂并就成像仪显影，上述3次上述操作。③细胞增殖。采用MTT法完成两组食管上皮细胞增殖情况。收集两组经不同方法干预后的细胞，加入75%乙醇500uL，放入4℃冰箱中，过夜；PBS2次洗涤后收集细胞，向每孔中加入MTT溶液20uL，浓度为5mg/mL，37℃下完成24h培养，细胞破碎后492nm波长下完成吸光度值OD值测定，绘制细胞生长曲线。④细胞侵袭。采用Transwell法测定两组细胞侵袭情况。取两组干预后的细胞，以1×105个密度接种在24孔板Transwell中，每孔中设置复孔5个，并且在上室加入200uLDMEM：F12培养基中，下室加入600uLDMEM：F12培养基，并且在37℃细胞培养箱中连续完成48h培养，吸取下室中培养液，加入结晶紫染色液100uL/孔，连续完成10min染色，染色完毕后采用PBS进行2次洗涤，400倍显微镜下连续取视野5个细胞并取平均值[2]。
1.3统计分析
采用SPSS18.0软件处理，计数资料行χ2检验，采用n（%）表示，计量资料行t检验，采用（）表示，P<0.05差异有统计学意义。
2结果
2.1两组Nkx2.1/β-catenin信号通路关键蛋白、EMT相关蛋白表达比较Westernblotting法测定结果表明：观察组食管上皮细胞中N-cadherin、E-cadherin、GAPDH蛋白水平低于对照组（P<0.05），见图1。
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图1两组Nkx2.1/β-catenin信号通路关键蛋白、EMT相关蛋白表达比较
2.2两组细胞增殖比较
两组0h细胞增殖抑制率比较无统计学意义（P>0.05）；观察组干预后6h、12h、24h细胞增殖抑制率高于对照组（P<0.05），见表1。
表1两组细胞增殖比较（）
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2.3两组细胞侵袭比较
Transwell法测定结果表明：观察组细胞培养24h后细胞穿过基膜的细胞数量为（28.45±5.41）个低于对照组（82.59±8.94）个（P<0.05），见图2。
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图2两组细胞侵袭比较
注：A图为对照组细胞侵袭结果；B图为观察组细胞侵袭结果。
3讨论
食道与气管共同由胚胎时期的前肠发育形成。前肠畸形与前肠发育密切相关。临床研究发现[3]：前肠发育畸形患儿与Noggin基因位点缺失有关，同时还发现的相关突变基因有Mycn和Sox2。动物模型研究发现[4]：导致前肠发育畸形的有Shh、Sox2、Noggin、Nkx2.1、β-catenin等基因及阿霉素。因此，Nkx2.1、Sox2等基因成为研究前肠分化发育疾病发生、发展的重要研究靶标。
Nkx2.1信号通路在人体中相对重要，能调节、控制胚胎发育，当该信号通路异常时，则能造成胚胎的异常发育及细胞的恶性增殖、分化。临床研究表明[5]：Nkx2.1信号的异常与多种肿瘤的发生、发展有关。而Nkx2.1/β-catenin信号通路能直接参与细胞的黏附、增殖过程，细胞中β-catenin蛋白的减少说明该信号通路受到不同程度抑制。国外学者研究表明[6]：Nkx2.1信号是高度保守的信号通路，主要分为经典Nkx2.1信号通路（即：Nkx2.1/β-catenin信号通路）和非经典信号通路（即细胞极性通路），且与Nkx2.1/Ca2+信号通路有关，在细胞的侵袭、增殖中发挥了重要的作用[7]。本研究中，Westernblotting法测定结果表明：观察组食管上皮细胞中N-cadherin、E-cadherin、GAPDH蛋白水平低于对照组（P<0.05）；两组0h细胞增殖抑制率比较无统计学意义（P>0.05）；观察组干预后6h、12h、24h细胞增殖抑制率高于对照组（P<0.05），说明通过调控Nkx2.1/β-catenin信号通路能抑制食管上皮细胞的增殖，能抑制前肠发育畸形的发生、发展[8]。临床研究表明[9]：Nkx2.1/β-catenin信号通路时生物体内较为重要的生存信号通路，能影响下游多种效应分子的活化状态，能影响细胞的凋亡、促进增殖，且与人类的多种肿瘤的发生、发展有关。为了进一步分析Nkx2.1/β-catenin信号通路在前肠发育畸形中的作用，本研究中对其细胞增殖的分析，Transwell法测定结果表明：观察组细胞培养24h后细胞穿过基膜的细胞数量为（28.45±5.41）个低于对照组（82.59±8.94）个（P<0.05），说明Nkx2.1/β-catenin信号通路能直接作用于食管上皮细胞中，能抑制食管上皮细胞的侵袭，能为前肠发育畸形治疗新的思路和方法[10]。
综上所述，通过调控Nkx2.1/β-catenin信号通路等影响食管上皮细胞的侵袭、增殖，能为前肠发育畸形的治疗提供新的靶点。
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