摘要：目的：研究进展期胃肠道肿瘤患者尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶1A1*28(UGT1A1*28)基因多态性与伊立替康化疗的毒性反应关系。方法：收集我科45例进展期胃肠道肿瘤患者化疗前外周血2ml，检测UGT1A1*28基因多态性。33例予以FOLFIRI方案，12例予以FOLFOX方案治疗。观察并记录化疗毒性反应及化疗前胆红素水平。统计分析UGT1A1*28基因型与化疗毒性反应及化疗前胆红素水平的关系。结果：45例患者中UGTIA1*28基因启动子区TA序列6次重复，为野生型(TA)6/(TA)6共34例,化疗前胆红素（11.6±5.7）umol/l；TA序列6次和7次重复，为杂合突变型(TA)6/(TA)7共11例,化疗前胆红素（12.0±4.0）umol/l。FOLFIRI方案组：(TA)6/(TA)6共23例；未发现Ⅲ级以上白细胞及粒细胞减少、贫血及血小板减少, Ⅲ级以上延迟性腹泻3例。(TA)6/(TA)7 患者10例；未发现Ⅲ级以上白细胞、中性粒细胞及血小板减少,Ⅲ级以上血红蛋白减低1例，Ⅲ级以上延迟性腹泻4例。FOLFOX方案组未发现Ⅲ级以上血小板减少、贫血、白细胞及中性粒细胞减少；发现Ⅲ级以上腹泻1例。FOLFOX与FOLFIRI组比较，后者严重延迟性腹泻发生率较高，但无统计学意义，（P=0.577）。FOLFIRI组中UGT1A1*28 (TA)6/(TA)6与(TA)6/(TA)7比较，后者严重延迟性腹泻发生率高，但无统计学意义，（P=0.161）。结论：UGT1A1*28野生基因型TA6/6在中国人中分布频率较高，而突变型发生率较低。UGT1A1*28基因型改变可能提示患者使用伊立替康后发生严重延迟性腹泻。UGT1A1*28基因型与化疗前胆红素水平无关。
关键词：UGT1A1 基因多态性 伊立替康 延迟性腹泻
A study on the relationship between UGT1A1*28 polymorphism and the toxicity of irinotecan in the patients with gastrointestinal tumor
Abstract：【 Objective 】To observe UGT1A1*28 genetic polymorphism and the association with the incidence rate and severity of adverse reaction of irinotecan-based chemotherapy in Chinese patients with advanced gastrointestinal tumor.【Methods】forty-five patients with advanced gastrointestinal tumor were enrolled.Among this patients、thirty-three of them threat with FOLFIRI and twelve with FOLFOX. All of them、we collected their peripheral blood 2ml into EDTA anticoagulant tubes before chemotherapy.and then UGT1A1*28 genetic polymorphism was analyzed by amplifying gene fragments using PCR and direct sequencing.The adverse reaction during chemotherapy and the billirubin(TB) level before treatment were compared in the patients with different UGT1A1*28 genotypes.【Results】34 cases(75.6%) were identified with TA6/6 wild genotype and with the TB(11.6±5.7)umol/l.And 11 cases(24.4%) were genotyped as heterozygote TA6/7、TB(12.0±4.0)umol/l.While we did not find TA7/7 genotype．Among the patients treated with FOLFIRI、23 cases（69.7%) with TA6/6、non of them were found with above Ⅲ magnitude thrombocytopenia、anemia、leukopenia and granulocytopenia.Above level Ⅲ delayed diarrhea only 3 cases（13%).compared to this、we found 10 cases(30.3%) genotyped with TA6/7 . No cases occured leukopenia、granulocytopenia and thrombocytopenia Above Ⅲ level.anemia above Ⅲ only 1 case(10%)、And 4 patients（40%） suffered delay diarrhea above Ⅲ level. There are 12 patients treated with FOLFOX.No one is exposed to above Ⅲ level leukopenia、granulocytopenia、anemia and thrombocytopenia. While one patients(8.3%) happened diarrhea above Ⅲ level.In the two groups、7 and 1 patients(21.2%VS 8.3%、P=0.577) had grade 3 and 4 delay diarrhea.The pretreatment billirubin levels of the two genotypes （TA6/6 VS TA6/7）of all patients were （11.6±5.7）umol/l and （12.0±4.0）umol/l、respectively （P=0.8）. Furthermore、the cases treated with FOLFIRI、3 and 4 patients(13.0% VS 40.0%、P=0.161) had grade 3 and 4 delay diarrhea of the two groups（TA6/6 VS TA6/7）. 【Conclusion】 UGT1A1 * 28 wild genotype TA6/6 distribution frequency is higher in the Chinese, and a lower incidence of mutant, this also is the main causes of less serious toxicity reaction in the patients with advanced digestive tract cancer were treated with CPT-11. And also、 UGT1A1*28 genotype changes may lead to severe toxic effects such as bone marrow suppression 、delayed diarrhea and so on when patients use CPT-11.The set for severe toxicity reaction mechanism is not clear、whether there are other factors、we need further research.
Keywords:UGT1A1 gene polymorphism irinotecan delayed diarrhea
正文：
前言：胃肠道肿瘤是严重威胁人类健康的常见肿瘤，其发病率及死亡率居高不下，且成逐年上升趋势。其治疗方案为根治性手术后辅以化疗【1】。既往胃肠道肿瘤化疗都是以氟尿嘧啶及其衍生物为主。随着分子生物学及药理学研究的进展，细胞毒类药物的出现（如奥沙利铂、伊立替康等）使化疗效果有了较大提升。尤其是伊立替康，明显提高了胃肠道肿瘤化疗效果，中位生存期进一步延长【2】。CPT-11为人工合成的可溶性喜树碱类药物，经羧酸酯酶(Carboxylesterase，CES)水解形成7-乙基-10-羟基喜树碱（7-ethyl-10-hydroxy camptothecin，SN-38)，SN-38作用于细胞周期的S期，抑制拓扑异构酶1，进而抑制DNA修复，促进细胞凋亡。发挥抗肿瘤活性后SN-38经尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶1A1(UDP-glucuronosyl transferaselAl，UGTIAI)作用形成葡糖甘酸(SN-38G)，从而解毒。然而国内外报道伊立替康引起的严重延迟性腹泻及粒细胞减少发生率较高，甚至使患者死亡【3，4】。根据CPT-11的代谢过程，UGT1A1影响CPT-11转化为SN-38，进而影响其毒性反应。国内外研究表明基因多态性在伊立替康作用机制中起重要作用。尤其是UGT1A1*28 可能引起UGT1A1表达下降，使SN-38向SN-38G转化减少，从而引起严重延迟性腹泻及粒细胞减少。可见UGT1A1的多态性与伊立替康疗效及毒性密切相关【5、6】。在肝脏中、UGT1A1酶具有胆红素葡萄糖醛酸化反应活性，其基因突变可引起胆红素升高的Gilbert综合征。而研究显示UGT1A1 基因多态性的分布存在人种差异【7】，从而导致伊立替康的毒性及疗效也存在人种差异。为了解中国人UGT1A1基因多态性的分布情况、及与CPT-11严重毒性反应关系，我们对45例胃肠道肿瘤患者进行此项研究。
1. 材料与方法：
1.1 研究对象，纳入标准及排除标准：
选取我院2014年5月至2015年5月于经术后病理证实为进展期胃肠道恶性肿瘤患者共45人，随机分为A组和B组，均为汉族，其中男（29）,女（16）,年龄（39-75岁，中位年龄57岁），病理组织分型：胃癌12例（26.7%）、结肠癌10例(22.2%)、直肠癌23例(51.1%)。
纳入标准：18-75岁，病理证实为进展期胃肠道恶性肿瘤，KPS评分≥70，预计生存期≥3月，血液学标准：WBC≥4.0×109/L，ANC≥1.5×109/L，PLT≥70×109/L，HB≥80g/L；血生化：胆红素及肌酐小于正常值1.5倍，转氨酶小于正常值2.5倍；心电图正常，未经化疗或距末次化疗4周以上，无急性感染性疾病。本研究经本院伦理委员会批准，入组患者均签署知情同意书。
排除标准：伊立替康过敏史，妊娠或哺乳期患者，有生育能力而未采取充分避孕措施者，存在未控制的感染，精神异常，消化道出血，肠梗阻，黄疸，腹水及严重心肺疾患，放化疗结束未满4周者，同时合并其他抗肿瘤治疗患者。
1.2 治疗方案：
方案A：FOLFIRI方案（3周一次）
LV：200mg/m2 静滴2小时 D1-3天
5-FU：400mg/m2 静推 D1-3天
5-FU：600mg/m2 静滴 D1-3天
CPT-11:150-180mg/m2 静滴60-90分钟 D1天
方案B：FOLFOX方案（3周一次）
LV：200mg/m2 静滴2小时 D1-3天
5-FU：400mg/m2 静推 D1-3天
5-FU：600mg/m2 静滴 D1-3天
奥沙利铂：85-125mg/m2 静滴大于2小时 D1天
每3周重复，总共4-8周期；每周期化疗前查白细胞、中心粒细胞、血小板、血红蛋白、肝肾功，肿瘤标志物，心电图；每2-4周期行胸腹部增强CT检查。若患者无法耐受毒副反应或病情进展，出现严重不良反应或实验室检查明显异常时暂停止化疗或推迟化疗大于2周。并积极处理相关毒副作用。
1.3 观察指标及毒性评价标准：记录化疗期间的相应不良反应如：恶心，呕吐，食欲减低，延迟性腹泻，周围神经毒性；化疗前后血常规、生化检查，包括白细胞，中性粒细胞，血红蛋白，血小板，总胆红素，转氨酶，肌酐；心电图检查。参照NCI-CTC 2.0将毒性反应分级，Ⅲ、IV级为严重毒性反应。
1.4 实验方案：
1.4.1 标本采集：患者术后入组行第一次化疗前抽取外周静脉血2ml，并置于EDTA抗凝管后冻存于-70℃冰箱待用。
1.4.2 检测方法：采用PCR检查基因多态性：采用Qiagen试剂盒抽提全血基因组DNA进行PCR扩增,随后将PCR产物进行毛细管电泳。GeneMapper软件分析结果。
1.5 资料收集：纳入研究患者在行化疗前抽取外周静脉血查患者血常规，肝肾功能，胆红素水平；并随访毒性反应情况，重点随访延迟性腹泻情况（化疗24小时后至下一次化疗前出现每天大便次数超过化疗前的正常大便次数，出现稀便或水样大便即为延迟性腹泻），观察并记录发生时间，程度并进行分级，及时予以易梦停治疗。外周血标本检测UGT1A1*28基因型并记录基因多态性情况。所有患者完成4-8周期化疗，最后统计患者一般情况，毒副反应情况，基因多态性等情况，并进行统计学分析。
2.统计学方法：化疗前总胆红素差异用t检验；UGT1A1*28基因型与不良反应关系用校正卡方检验或Fisher，s精确检验；危险因素分析和干扰因素排除用Logistic回归分析。P<0.05为差异具统计学意义，采用SPSSl7.0软件进行分析。
结果：
1. 纳入患者UGT1A1*28基因多态性分布情况
纳入研究的45列患者中野生型(TA)6/(TA)6即(UGTIA1*1/*1)共34列（75.6%）；杂合突变型(TA)6/(TA)7即(UGTIA1*28/*1)患者11例(24.4%)；未发现TA序列7次重复的纯合突变型UGTIA1*28/*28。我们将基因型与患者年龄、性别、KPS评分、肿瘤部位及化疗方案进行卡方检验，结果无统计学差异，P>0.05。UGT1A1*28基因多态性检测结果如图1。
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图1.UGT1A1*28基因多态性检测结果
2. FOLFIRI及FOLFOX方案患者毒性反应情况
在予以FOLFIRI方案治疗的33列患者中：(TA)6/(TA)6共23列（69.7%）；其中未发现Ⅲ级以上白细胞减少、粒细胞减少、贫血及血小板减少, Ⅲ级以上延迟性腹泻3列（13.0%）。(TA)6/(TA)7 患者共10列（30.3%）；未发现Ⅲ级以上白细胞减少、中性粒细胞减少及血小板减少,Ⅲ级以上血红蛋白减低1列（10%），Ⅲ级以上延迟性腹泻4列（40%）。12列予以FOLFOX方案治疗患者中未发现Ⅲ级以上白细胞、粒细胞、血小板减少及贫血；Ⅲ级以上腹泻1列（8.3%）；周围神经毒性5例（41.7%）。在两类化疗方案中我们观察到FOLFOX方案的主要毒性反应为周围神经损害；FOLFIRI为延迟性腹泻；FOLFOX方案延严重腹泻发生率为8.3%，FOLFIRI方案则高达21.2%，后者严重延迟性腹泻发生率明显高于前者，但P=0.577、无统计学意义。其他毒性反应如血液系统损害，肝肾功能损害等多为轻度，予以对症处理后好转，无相关死亡事件发生。
3. Ⅲ-Ⅳ级延迟性腹泻及其影响因素
本实验观察到的威胁患者安全的主要毒性反应为严重延迟性腹泻（即3、4级延迟性腹泻），我们将严重延迟性腹泻与患者相关临床因素如年龄、性别、KPS评分、化疗方案、肿瘤原发部位及UGT1A1*28基因型进行卡方检验，发现所有结果均无统计学意义（P>0.05）。如表1。
表1.纳入研究患者严重延迟腹泻有关因素分析
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在FOLFIRI方案中我们将可能导致严重腹泻的危险因素进行Logistic回归方程，得出相对危险度及P值(见表2)，结果证实年龄、性别、KPS评分、肿瘤原发部位及基因型等危险因素与严重腹泻均无相关性。
表2.FOLFIRI方案中致严重腹泻危险因素Logistic回归分析
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根据表1、2结果，我们推测UGT1A1*28基因型可能影响患者化疗严重延迟性腹泻，故我们在FOLFIRI方案组中将其进行Fisher精确检验（见表3）。我们可以看出TA6/7基因型严重延迟性腹泻发生率高于TA6/6，但P>0.05，故无统计学意义。
表3.FOLFIRI方案中严重腹泻与UGT1A1*28基因型关系
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4. 患者化疗前胆红素水平与UGT1A1*28基因多态性关系
我们尚将患者化疗前胆红素水平与患者UGT1A1*28基因型相关性进行t检验（如表4）。结果显示TA6/7基因型患者化疗前胆红素水平稍高于TA6/6基因型患者，P=0.8，无统计学意义。
表4.UGT1A1*28基因型与化疗前总胆红素水平相关性分析
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讨论：
FOLFOX和FOLFIR为进展期胃肠道肿瘤化疗常用方案，本实验将两方案毒性反应对比研究显示FOLFOX方案严重腹泻发生率为8.3%，FOLFIRI方案则高达21.2%，后者严重延迟性腹泻发生率明显高于前者，但P=0.577、无统计学意义，但具有统计学趋势。而有研究显示相对FOLFOX方案FOLFIRI主要毒性反应为延迟性腹泻和骨髓抑制【8】。而FOLFOX方案主要毒性反应为外周神经损害。结合本研究结果，FOLFIRI方案主要毒性反应为延迟性腹泻，骨髓抑制仅1例。故下面主要对FOLFIRI所致延迟性腹泻进行讨论。
伊立替康为半合成水溶性喜树碱。作用于细胞周期S期，抑制TOPO Ⅰ而发挥抗肿瘤活性。已用于消化道及呼吸道等实体肿瘤的治疗【9】 。在体内CPT-11经代谢后转化为SN-38，进而发挥抗肿瘤作用，然而SN-38在作用于肿瘤细胞同时也影响正常细胞，继而引起其毒性反应如骨髓抑制和延迟性腹泻的发生。而在肝内和肠内的UGT1A1可将SN-38灭活【10】，因此伊立替康的毒性反应与UGT1A1密切相关，而该酶的表达及活性受UGT1A1基因多态性的影响，该基因突变后引起UGT1A1的表达减少及活性降低，SN-38增多致使伊立替康毒性反应增加。同时UGT1A1也可催化胆红素发生醛酸化反应，其基因突变同样会影响胆红素代谢，导致化疗前胆红素升高。
UGT1A1基因突变多达50余种，UGT1A1*28多态性与CPT-11毒性反应关系备受关注【11】。其多态性分布存在明显的种族差异，国外研究显示UGT1A1*28突变频率较高，而国内则相对较低。本研究显示UGTIA1*28野生型(TA)6/(TA)6即(UGTIA1*1/*1)共34例（75.6%）；杂合突变型(TA)6/(TA)7即(UGTIA1*28/*1)患者11例(24.4%)；未发现TA序列7次重复的纯合突变型UGTIA1*28/*28。该结果与杨立学等研究结果类似【9】。由于UGT1A1基因多态性分布差异及其突变后导致SN-38增加，从而导致临床上CPT-11毒性反应差异。
为此我们对FOLFIRI组进行UGT1A1*28基因型与3-4级延迟性腹泻关系对比分析，用Fisher精确检验提示野生型TA6/6严重延迟性腹泻发生率为13%,而杂合突变型TA6/7为40%,但P=0.161，无统计学意义。但我们可以看出突变型患者严重延迟性腹泻发生率较野生型明显偏高。本实验结果无统计学意义可能是因为纳入研究对象少，我国UGT1A1*28基因突变率低以及本研究中CPT-11剂量小，化疗周期间隔长以及患者使用伊立替康后严重延迟性腹泻发生尚受其他因素影响等，为此我们后期将继续进行大样本研究，并将CPT-11剂量及化疗间隔周期考虑进去，并注意分析各剂量各间隔周期下患者毒性反应、疗效，进而为我们选择适宜个体化化疗方案及药物剂量，间隔周期等提供依据。
前期国内外大量研究还显示CPT-11可至严重骨髓抑制而至白细胞、中性粒细胞、血小板、血红蛋白减少。然而本研究中FOLFIRI方案纳入33例患者，而仅发现1例严重血红蛋白减低，未发现严重白细胞、中性粒细胞、血小板减少。故未将其与UGT1A1*28基因型进行分析。
由于患者临床因素如年龄、性别等可能影响患者化疗毒性反应发生，故我们将患者临床资料与严重延迟性腹泻进行分析，结果显示均无统计学意义。
胆红素代谢过程中的关键酶为UGT1A1，其基因突变引起总胆红素水平升高。研究证实化疗前总胆红素水平差异与UGT1A1*28基因多态性有关【12】。因患者化疗前总胆红素水平检测简单、经济，我们是否可以通过化疗前总胆红素水平初步判断患者基因型及CPT-11治疗后毒性反应情况？故我们将患者化疗前胆红素水平同患者UGT1A1*28基因型进行分析，然而结果无统计学意义，P>0.05。由于本实验研究对象少，故我们尚需进行进一步研究。
综上所述，本实验证实UGT1A1*28杂合突变增加伊立替康治疗后严重延迟性腹泻的风险，对严重白细胞和(或)粒细胞减少的风险无明显影响。由于UGT1A1*28杂合子较野生型纯合子发生严重毒性反应高，虽无统计学意义，但具有统计学趋势，故我们推测，通过增加研究样本量可能出现具有统计学意义的结果；另外根据患者基因型与严重延迟性腹泻关系对比研究，我们推测若为纯合突变基因型则可能具有统计学意义。但同时我们推测是否有其他因素影响伊立替康毒性反应？其严重毒性反应是否仅与患者UGT1A1*28基因型有关？其他基因型是否与其毒性有关？本实验纳入研究对象偏少，检测因素少，尚不足以反应相关情况，对于基因型与CPT-11化疗毒性反应关系尚需进一步研究。后期我们可以进一步完善大样本、多中心，多基因位点的研究（如UGT1A1*6，MDR1,ABCG2基因），并将化疗药物使用剂量及间隔时间，疗效等纳入进行研究，为个体化治疗提供依据。
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