[摘要]目的:探讨平坚洗剂对膝骨关节炎（KOA）的疗效及关节液中MiR-140的影响。方法:选择2018年2月~2019年1月于我院住院治疗的100例KOA患者为研究对象，简单随机数字表法分为观察组和对照组，每组50例。对照组患者使用硫酸氨基葡萄糖治疗，观察组患者在对照组患者基础上使用平坚洗剂外洗治疗。随访1个月，记录并比较两组患者治疗前后关节液中MiR-140表达情况、骨关节炎指数（WOMAC）、炎性因子水平变化及临床疗效。结果:治疗前，两组患者的MiR-140表达情况、WOMAC评分、IL-1、IL-6水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。治疗后，两组患者的MiR-140水平均较治疗前升高，且观察组患者高于对照组患者，而WOMAC评分及IL-1、IL-6水平均较治疗前降低，且观察组患者低于对照组患者，差异具有统计学意义（P<0.05）。两组患者的临床疗效比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。观察组患者的临床疗效总有效率为94.00%，优于对照组患者的80.00%，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:平坚洗剂可提高KOA患者关节液中的MiR-140表达情况，有效减轻炎症反应，改善关节活动功能，疗效显著。
[关键词] 平坚洗剂；膝骨膝关节炎；关节液；MiR-140；临床疗效
膝骨膝关节炎（Knee osteoarthritis,KOA）是多发于老年群体的慢性关节疾病，患者主要表现为继发性骨质增生及关节退行性病变。患者多伴随膝关节活动困难、疼痛、肿胀，严重者甚至瘫痪[1]。目前，西医临床针对早期KOA患者多以药物控制为主，而晚期患者则需接受关节置换术，但术后并发症情况较多[2]。随着中医理论在临床治疗中的广泛应用，中药方剂在KOA的治疗中获得不错的疗效[3]。虽然中药外用在蛋白质组学、基因组学等方面对治疗KOA具有尚佳疗效，但关于中药外用在KOA治疗的报道相对匮乏[4]。而有研究表明，mir-140表达于多种骨关节炎病变患者的膝关节液中，且mir-140的表达与骨关节炎病变存在显著相关性[5]。基于此，本研究探讨了中药外用方剂平坚洗剂对KOA患者关节液中mir-140的影响及临床疗效，现将结果报道如下。
1 资料与方法
1.1一般资料
选择2018年2月~2019年1月于我院住院治疗的100例KOA患者为研究对象，简单随机数字表法分为观察组和对照组，每组50例。纳入标准：①符合美国风湿病学会制定的KOA诊断标准[6]：就诊前1个月内膝关节疼痛天数≥14d、膝关节活动伴骨摩擦声、X线显示膝关节骨端边沿骨赘形成或是骨质增生、膝关节晨僵时间≤30min、年龄≥40岁、关节液清亮、黏稠，白细胞计数<2*109/L；②年龄≤75岁。排除标准：①合并心、肝、肺、肾等功能障碍患者；②依从性较差患者；③对本研究使用药物禁忌患者；④恶性肿瘤患者；⑤血液系统疾病；⑥近3个月服用过非甾体抗炎药、糖皮质激素患者；⑦感染性关节炎、膝关节手术史患者。观察组中男28例、女22例，年龄为45~75岁，平均（55.24±9.78）岁，病程平均（3.44±0.71）年，膝骨关节炎Kellgren-Lawrence (K-L)分级[7]：17例Ⅱ级、20例Ⅲ级、13例Ⅳ级，中医证候分型：22例肾虚髓亏型、16例阳虚寒凝型、12例瘀血阻滞型。对照组中男29例、女21例，年龄46~75岁，平均（55.32±9.87）岁，病程平均（3.54±0.84）年，K-L分级：15例Ⅱ级、23例Ⅲ级、12例Ⅳ级，中医证候分型：20例肾虚髓亏型、17例阳虚寒凝型、13例瘀血阻滞型。两组患者的性别、年龄、病程、K-L分级、中医证候分型等比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表1。此研究经我院伦理委员会同意，患者家属知晓并签署知情同意书。
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1.2方法
1.2.1治疗方法
对照组患者使用硫酸氨基葡萄糖治疗：硫酸氨基葡萄糖胶囊（国药准字H20041317，新兴同仁药业有限公司，0.314克(相当于硫酸氨基葡萄糖0.25克)）口服，进餐时服用，1-2片/次，3次/d，30d为1疗程，连续服用1个疗程。
观察组患者在对照组患者基础上使用平坚洗剂治疗：洗剂配方：5g细辛，10g花椒，白芷、独活、羌活、艾叶、透骨草、伸筋草各20g、500g威灵仙。将上述组方药物放于专门治疗仪器中，反复2次煎汁后，将药渣倒入布袋内并置入盆中，并加入适量清水及陈醋，予以加热，趁热充分熏蒸患膝，边熏蒸边按摩，温度降低，重新加热，反复熏蒸。30min/次，2次/d，2周为1疗程，连续治疗2个疗程。
1.2.2检测方法
采集两组患者治疗前（入院时）、治疗后（治疗后1个月）的关节液：嘱患者取平卧位，局部消毒、麻醉膝关节，髌上外侧穿刺膝关节腔，抽取约2ml关节液，室温静置1h，再3000r/min，离心处理20min，弃关节组织碎片及细胞，得上清液，-80℃冷藏待检。MiR-140检测：①提取总RNA：TRizol法。分光光度计检测RNA浓度，变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量；②逆转录：反应体系组成：2 μl 10×RT Buffer、0.3 μl RNA酶抑制剂（40 IU/μL）、2 μl MMLV反转录酶（10 IU/μL）、0.5 μl RT特异引物（1μM）、2 μl dNTP（2.5 mM each）、0.3 μg总RNA，共20 μl。反应条件：16℃，30min→42℃，40min→85℃，5min，反应结束，先于冰上冷却5min，再-80℃冷存；③RT-PCR扩增：0.2 μl 2×ROX Reference Dye、0.4 μl 10 μM的PCR特异引物R、0.4 μl 10 μM的PCR特异引物F、0.25×至终浓度 Sybergreen I、0.5 IU Taq聚合酶、0.6 μlMgCl2溶液、1.0 μl 10×PCR缓冲液、1.0 μl dNTP（2.5 mM each），共8 μl。反应条件：先95℃，3min；再95℃，15s→60℃，30s→70℃，30s，循环40次，重复3次实验。内参为U6 snRNA，上游引物为5'-GCCT-CAGTGGTTTTACCCTA-3'，下游引物为5'-GTGCAGGGTC-CGAGGT-3'，数据根据公式2-△△CT法分析[8]。
1.3观察指标
随访1个月，记录并比较两组患者治疗前（入院时）、治疗后（治疗后1个月）关节液中MiR-140表达情况、骨关节炎指数（WOMAC）、炎性因子水平变化及临床疗效。
骨关节炎指数WOMAC量表包括17项功能活动条目、2项僵硬条目、5项关节疼痛条目，共24项，每项条目0~4分，总分0~96分，分数越高表示症状越严重[9]。炎性因子包括白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6），采集两组患者治疗前（入院时）、治疗后（治疗后1个月）清晨空腹状态外周血，2000r/min，离心处理5min，得血清，酶联免疫吸附法（ELISA）检测IL-1、IL-6水平，试剂盒均由上海酶联生物科技有限公司提供，严格按照试剂盒说明操作。
疗效标准[10]：临床治愈：关节活动恢复正常，临床症状完全消失，WOMAC评分减少≥95%；显效：关节活动无限制，临床症状明显改善，WOMAC评分减少70~95%；有效：关节活动轻微受限：临床症状有所改善，WOMAC评分减少30~70%；无效：关节活动严重受限，临床症状为改善甚至加重，WOMAC评分减少<30%。疗效总有效率=（临床治愈例数+显效例数+有效例数）/总例数*100%。
1.4统计学方法
数据使用SPSS 22.0软件处理。其中，计数资料用n(%)表示，组间用x2检验；符合正态分布的计量资料用（）表示，组间用独立样本t检验，组内治疗前后用配对样本t检验，临床疗效等级资料用Mann-Whitney U 检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1 两组患者治疗前后的关节液中MiR-140表达情况比较
治疗前，两组患者的MiR-140表达情况比较，差异无统计学意义（P>0.05）。治疗后，两组患者的MiR-140水平均较治疗前升高，且观察组患者高于对照组患者，差异具有统计学意义（P<0.05），见表2。
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2.2 两组患者治疗前后的WOMAC评分及IL-1、IL-6水平比较
治疗前，两组患者的WOMAC评分及IL-1、IL-6水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。治疗后，两组患者的WOMAC评分及IL-1、IL-6水平均较治疗前降低，且观察组患者低于对照组患者，差异具有统计学意义（P<0.05），见表3、4、5。
2.3 两组患者的疗效比较
两组患者的临床疗效比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。观察组患者的临床疗效总有效率为94.00%，优于对照组患者的80.00%，差异具有统计学意义（P<0.05），见表6。
3讨论
miR-140是一种在软骨细胞中特异性高表达的miRNAs，其主要作用为参与人类软骨生成、发育调控及维持软骨细胞稳定[11]。而最新研究发现，miR-140与KOA的发生密切相关[12]。推断miR-140在KOA中的作用机制为：miR-140通过调控转化生长因子-β受体1（TGF-βR1）、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）等靶基因降低KOA发生率；KOA患者软骨细胞病变，使得miR-140生成减少，而软骨细胞凋亡则使得miR-140降解增加[13]。miR-140在KOA中具体作用机制尚不明确，需进一步深入研究。
此外，炎症反应在KOA的发生、进展中扮演重要角色。李灿锋[14]等研究表明，miR-140在不同程度的膝骨关节炎软骨细胞中的表达量逐渐降低，而经IL-1β诱导后，miR-140的表达量又显著升高，提示miR-140在KOA中的作用受到炎性因子水平的影响。而作为最常见的炎性因子，IL-1、IL-6在KOA中的作用机制为：IL-1是KOA中的重要促炎因子，而IL-6是参与软骨蛋白分解的负反馈调节的关键炎性因子，两者不但共同抑制软骨组织合成过程，而且是破坏分解软骨组织的重要介质[15]。因而，IL-1、IL-6水平越高，关节软骨病变程度越高，miR-140表达水平越低，关节僵硬、肿胀、疼痛及运动功能障碍等临床症状更严重。
本研究结果表明，治疗后，两组患者的IL-1、IL-6水平明显降低且观察组患者低于对照组，说明平坚洗剂可降低KOA患者血清内的IL-1、IL-6水平，可更为有效地减轻炎症反应；而两组患者关节液中的miR-140表达情况均较治疗前有明显提升，且观察组患者表达水平高于对照组患者，究其原因为：平坚洗剂通过降低IL-1、IL-6等炎性因子水平，缓解炎症反应及软骨病变进程，故使得miR-140水平升高。此外，观察组患者的WOMAC评分改善程度亦大于对照组患者，与王鑫等[16]研究结果相同，提示平坚洗剂外洗的疗效显著。
综上所述，平坚洗剂可提高KOA患者关节液中的MiR-140表达情况，有效减轻炎症反应，改善关节活动功能，疗效显著。
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