刘敬敬 陈雷通讯作者
（厦门市儿童医院；福建厦门361006）
【摘要】目的：利用蛋白重组技术构建分子伴侣蛋白（Chaperone protein, CP）大肠杆菌表达系统，并初步探讨CP的免疫学效应。方法：采用蛋白重组技术将 CP基因插入到表达载体pET30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性，最终分别转到 Top10 克隆菌株和 BL21(DE3)表达菌株中，通过 IPTG诱导表达CP，之后通过亲和层析（Ni-IDA树脂）纯化CP；利用流式细胞术检测纯化后的CP蛋白对小鼠髓系树突状细胞（Dendritic cells, DC）水平以及分泌IL-6与IL-8的作用。结果：SDS-PAGE分析CP蛋白于BL21(DE3)表达，分子量约为40；重组CP蛋白质检结果显示，蛋白纯度>90%，内毒素含量<1EU/μg；流式结果显示，CP蛋白可显著增加CD11c/CD80与CD11c/CD86阳性的DC细胞比例；同时ELISA结果显示，纯化的CP促进了DC细胞IL-6与IL-8等细胞因子分泌。结论：本研究建立了重组CP大肠杆菌表达系统，诱导表达和纯化的CP浓度较高，且体外实验研究证明具有较强的免疫学效应，从而为临床应用打下了坚实的基础。
【关键词】分子伴侣蛋白；大肠杆菌；重组蛋白；免疫学效应
Construction of Chaperone protein expression system and preliminary study of immunological function
[Abstract] Objective: To construct the escherichia coli expression system of Chaperone protein (CP) by using protein recombination technology, and to preliminarily investigate the immunological effect of CP. Methods: The Chaperone gene was inserted into the expression vector pET30a by protein recombinant technology, and the accuracy of the final expression vector was confirmed by enzyme digestion and sequencing. Finally, the Chaperone gene was transferred to the Top10 cloned strain and the BL21(DE3) expression strain, respectively. CP was induced by IPTG, and CP was purified by affinity chromatography (ni-ida resin). Flow cytometry was used to detect the effects of the purified CP protein on the levels of myeloid Dendritic cells (DC) and the secretion of il-6 and il-8 in mice. Results: sds-page was used to analyze CP protein expression in BL21(DE3) with molecular weight of 40. The quality control results of recombinant CP protein showed that the protein purity was >90% and the endotoxin content was <1EU/ g. Flow flow results showed that CP protein significantly increased the proportion of CD11c/CD80 and CD11c/CD86 positive DC cells. At the same time, ELISA results showed that the purified CP promoted the secretion of cytokines such as il-6 and il-8 in DC cells. Conclusion: The recombinant CP escherichia coli expression system was established in this study. The induced expression and purified CP concentration were relatively high, and the in vitro experimental study proved that it had a strong immunological effect, thus laying a solid foundation for clinical application.
[key words] Chaperone protein; E. coli; Recombinant protein; Immunological effect
分子伴侣蛋白（Chaperone protein, CP）主要功能被认为是参与蛋白质的正确折叠，促进折叠错误蛋白质的降解，不仅参与机体新生肽链的形成，而且在蛋白质的运送过程发挥了较为重要作用[1-2]。近年来，CP的免疫学功能研究也随着免疫学的理论研究而逐渐深入，尤其是CP参与肿瘤免疫的研究[3]。人们发现，CP可能参与了外源性抗原交叉呈递过程，且在抗原提呈过程中发挥着较为重要的作用[4]。另有研究发现，当采用HSP90抑制剂抑制除莠霉素与格尔德霉素处理抗原提呈细胞（Antigen presenting cells, APC）后，发现APC细胞的抗原提呈能力显著下降，表明CP可能参与了机体的免疫学过程，具有一定的免疫学效应[5]。此外，由于CP富含MHCⅠ类分子结合特征的肽段，CP也被认为可能参与了CD8+T细胞介导的适应性免疫应答过程[6]。CP在体内分布虽较为广泛，但含量甚微，因此，构建CP大肠杆菌表达系统以诱导CP的表达与纯化对CP的深入研究具有关键性作用。重组蛋白是指运用DNA重组技术或RNA重组技术获得的一类蛋白质[7]。近年来，随着分子生物学研究的深入，重组蛋白开始渐渐应用于各个领域。大肠杆菌由于其具有遗传背景清晰、目的基因可高表达的特点，现逐渐成为一种重要的分子生物学工具[8]。本研究主要利用重组DNA技术，构建CP蛋白的大肠杆菌表达系统诱导其表达进而纯化，并初步探讨纯化后的CP蛋白对小鼠髓系树突状细胞（Dendritic cells, DC）的作用。
1材料方法
1.1材料
（1）质粒与菌株
表达CP的载体质粒pET30a由德泰生物实验室构建，大肠杆菌菌株 BL21(DE3)由德泰生物科技有限公司提供。
（2）试剂
酵母提取物、蛋白胨（英国OXOID公司）；质粒提取试剂盒、DNA 回收试剂盒、T4DNA 连接酶与Taq DNA 聚合酶（大连生物工程有限公司）；ECL 试剂盒（南京恩晶生物科技有限公司）；IPTG、硫酸卡那霉素、SDS-PAGE 和 WB Marker（AMRESCO公司）；丙烯酰胺( Acrylamide)、甲叉双丙烯酰胺( Bis)、过硫酸铵(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)、Bradford 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；流式抗体CD11c、CD80、CD86（美国BD公司）其他试剂为BBI公司。
（3）仪器
DNA 合成仪（MerMade-192E, BIOAUTOMAION公司）；超声细胞破碎仪（JIUPIN-R1200, 无锡久平仪器有限公司）；恒温培养箱（HWS-1000, 无锡久平仪器有限公司）；台式高速离心机（Centrifuge 5418, Eppendorf）；超净工作台（SW-CJ-ZD, 苏州净化设备有限公司）；核酸电泳仪（DYCP-31A, 北京北京六一生物科技有限公司）；恒流泵、紫外检测仪、电泳系统等购自南京大学普阳分析仪器厂；激光八色流式细胞仪（FACS, 美国BD公司）。
1.2方法
1.2.1目的基因的表达
通过正确的接种方法将构建好的含有CP基因的质粒pET30a转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞接种于含有硫酸卡那霉素（50μg/mL）的LB培养基内，至于37℃恒温培养箱并倒置过夜；进行挑克隆操作，挑选的单克隆置于含有硫酸卡那霉素（50μg/mL）的LB培养基内接种培养，在培养至吸光度OD值在0.5-0.8范围内时，加入强诱导剂IPTG（0.2 mM ）并于37℃与15℃温度条件下使其表达；采用蛋白免疫印迹法对诱导表达结果进行鉴定分析。待取样测定OD600值为0.8时，加入IPTG（0.2 mM ），在15℃条件下诱导表达16小时收集2L菌体。
1.2.2 CP的纯化
（1）上清中亲和层析纯化CP 在低温条件下操作。
（2）树脂的活化 将预装柱垂直固定于铁架台上，将ToxinEraserTM 内毒素树脂预装柱顶部的盖子除去，将流速控制器打开并使保护液放完；注入冷却的再生性缓冲液，延柱壁缓缓倒入，以控制流速为0.25ml/min，进而使再生缓冲液流干；上述步骤连续操作3次，以确保无热原（即内毒素）存在。
（3）树脂的平衡 树脂活化后，沿柱壁缓缓加入7 ml的平衡缓冲液，保持保持流速在0.5 ml/min，待再生缓冲液流干，同时，利用平衡缓冲液对柱壁进行冲洗，连续3次。
（4）内毒素的去除 关闭流速控制器，利用无热源枪头将CP蛋白沿柱壁加入，打开控制器，此时控制流速为0.25 ml/min，待流出液达到2 ml时，利用无热源接收管接收流出液，流完后利用平衡缓冲液进行淋洗并合并淋洗液；检测相应样品及所含内毒素浓度水平。
1.2.3 重组CP的质检
①CP稳定性测试（冻融实验）
取出置于负80℃条件下的CP小包装样品，置于0℃的冰水混合物条件下，缓慢融化过程中观察有无异常现象，若无异常现象，说明 CP冻融实验是正常的。
②CP浓度测定
测定蛋白浓度采用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒。
4.3 CP WB 检测WB 实验操作流程参考《蛋白质电泳实验技术》 郭尧君著，结果请见对应质检报告。
③ CP内毒素检测 通过凝胶法内毒素检测试剂盒测定。
1.2.4重组CP对小鼠髓系 DC的影响
将上述获取的重组CP作为刺激剂（5μg/mL）作用于原代培养9天的小鼠股骨与胫骨的髓系DC（106/mL），采取流式细胞术检测CP对DC的影响。
1.2.5重组CP对小鼠的细胞因子IL-6与IL-12水平的影响
将上述获取的重组CP作为刺激剂（5μg/mL）作用于原代培养9天的小鼠股骨与胫骨的髓系DC（106/mL），采用ELISA试剂盒检测CP对小鼠的细胞因子IL-6与IL-12水平的影响。
2结果
2.1目的基因在BL21(DE3)中的表达情况
将诱导表达的培养液进行离心（12000 r/5 min），弃上清，重悬，利用SDS-PAGE上样缓冲液于95-100℃煮8-10分钟，离心后利用上清进行电泳；100 V电压10分钟至溴酚蓝至分离胶位置时，调节电压至200V至蓝色条带转移至浓缩胶底端约1 cm，取出进行考马斯亮兰染色，随后脱色至凝胶背景清晰。如图1所示：
图1 SDS-PAGE 分析 CP于 BL21(DE3)表达系统中表达情况
（M条带: Marker ；0号条带: 对照；1号条带: 15℃诱导 16 h；2号条带: 37℃诱导 16 h）
2.2重组CP纯化结果
所有大肠杆菌置于超声细胞破碎仪内进行超声裂解，裂解条件为300 mM NaCl，50 mM Tris(pH8.0)，20 mM Imidazole，其中含1% Triton X-100，1% Triton X-114，1 mM PMSF，1 mM DTT；与此同时以缓冲液（300 mM NaCl，20 mM Imidazole，50 mM Tris(pH8.0)平衡 Ni-IDA 亲和层析柱；采用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱CP蛋白，收集各洗脱组分记性分析鉴定。结果如图2所示：
图2 SDS-PAGE 分析 CP上清纯化结果
（M条带: Marker；1号条带: 全菌破菌离心后的上清；2号条带: 上清同 Ni-IDA 孵育后的流出液；3-7号条带:5 0 mM Imidazole 洗脱组分；8-10号条带: 100 mM Imidazole 的洗脱组分；11-13号条带: 300 mM Imidazole 的洗脱组分）
2.3重组CP质检结果
质检报告显示，CP来自大肠杆菌表达系统；纯化所得的可溶性蛋白CP来源于上清；用 BSA 做标准品，采用 Bradford 法测定CP浓度为3.18 mg/ml； R250 染色的 SDS-PAGE 胶分析CP纯度>90%；凝胶法内毒素检测试剂盒测定内毒素含量<1EU/μg。CP长度、SDS-PAGE与WB检测结果如下图3，图4所示。
图4 SDS-PAGE与WB检测结果
（Lane 1: BSA (2.00 μg)；Lane 2: Chaperone protein (4.00 μg) M1: SDS-PAGE Marker；M2: Western Blot Marker；Using Anti-His antibody）
2.4 重组CP对小鼠两种髓系树突状细胞的影响
流式细胞术结果显示，重组CP刺激组的DC水平高于阴性对照组，提示重组CP可以显著增加DC数量以增加抗原提呈能力，进而增强固有免疫应答。如图5所示。
图5重组CP对小鼠两种髓系树突状细胞的
2.5重组CP对小鼠DC的细胞因子IL-6与IL-12水平的影响
ELISA结果显示，重组CP刺激组的IL-6与IL-12水平显著高于阴性对照组，提示重组CP可以显著促进小鼠DC分泌细胞因子，促进免疫应答的产生。如表1所示。
3讨论
作为广泛存在于人体内的一种高度保守的功能蛋白质，CP在人体生命活动中扮演了极其重要的角色[9]。CP也是一种应激蛋白，在人体处于应激状态合成较多，在保护机体细胞免受损伤的同时，也广泛参与了机体的固有免疫应答与适应性免疫应答[10]。
蛋白质的合成过程是一个集各类物质与能量为一体的过程，而蛋白质重组过程常涉及多种重要物质。在LB培养基中，葡萄糖不仅作为大肠杆菌合成CP的重要前体物质，同时过量的葡萄糖浓度可能会抑制CP的合成过程[11]，因此在构建CP的大肠杆菌表达系统时需要合理的控制葡萄糖浓度。同时，在合成过程中需要适量添加硫酸卡那霉素以维持高水平的转录效率，同时加大振荡力度以提高供氧量[12]。在原核生物表达系统中，外源性基因须诱导剂的诱导才得以表达[13]。IPTG是一种具有β–半乳糖苷酶活性的极强的诱导剂，因其不易被细菌所代谢，可使目的基因的表达量明显增高，产物稳定且易于鉴别与纯化，因此是原核生物系统中较为常用的一种启动子[14]。除此之外，对表达系统中终止子、核糖体序列、多克隆位点以及复制起始位点的要求也较高[15-16]。BL21(DE3)菌株由于存在蛋白酶缺陷，可避免蛋白酶的降解，进而提高目的基因的表达量[17]。
本研究中，蛋白质质检结果显示，大肠杆菌表达系统纯化后，上清中可溶性的目的蛋白即为CP蛋白，蛋白浓度高达3.18 mg/ml，采用 SDS-PAGE 胶分析纯化结果为大于90%，同时内毒素含量<1EU/μg，提示本研究构建的CP表达系统蛋白纯度较高，内毒素含量较低。此外，为初步验证纯化的CP的免疫学效应，利用纯化的CP刺激原代培养9天的小鼠髓系DC，流式结果显示，CD11c/CD80与CD11c/CD86阳性的DC细胞比例显著增加；同时ELISA结果显示，纯化的CP促进了DC细胞分泌IL-6与IL-8等细胞因子，证明了CP具有较强的免疫学效应，尤其是在DC细胞抗原提呈等功能方面发挥了重要作用，与文献报道基本一致。
综上所述，本研究建立了重组CP大肠杆菌表达系统，诱导表达和纯化的CP浓度较高，且体外实验研究证明具有较强的免疫学效应，从而为临床应用打下了坚实的基础。
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基金项目：福建省卫生计生青年科研课题（2016-2-71）