摘要：枣缩果病严重影响我国枣业发展，并且逐年呈现上升趋势。本研究从大棚枣园基地采取冰糖枣、胎里红枣、中华梨枣三种作为研究对象，对采摘后的病果进行多次的分离，并且根据柯赫氏法则对分离的病原菌进行鉴定。
关键词：分离 鉴定 枣缩果病
引言
枣属于鼠李科植物，是我国的原产果树之一，已经有千年的种植经验，具有适应能力强、品种较多等，受到大众的喜爱。但由于枣果自身保鲜能力差，并且在实际存储过程中很容易受到微生物的影响，导致枣果发生腐烂变质的情况，严重影响我国枣业的发展。枣果主要存在两种病害，一方面会受到外界因素的影响，导致出现生理病害，另一方面受到病原微生物而出现病理病害，可能会对枣叶片和枣果造成影响。因此，大力研究枣缩果病初始病原菌的分离与鉴定是十分有必要的。
1材料与方法
1.1材料
本文从大棚枣园基地采取冰糖枣、胎里红枣、中华梨枣三种并取病果实病健交界处肉组织放在PDA培养基中进行分离工作，将分离获得的菌株经单孢分离纯化之后，对形态进行观察，并放在果品专用保鲜膜中4oC保鲜。
分离培养基：PDA培养基（g/L）：马铃薯200，葡萄糖：20，琼脂：15。
1.2病原菌分离
（1）消毒分层分离法：将病果用清水清洗干净，然后利用浓度为70%的酒精，浸泡30s～60s，之后加入浓度为0.1%的升汞消毒进行3分钟消毒工作，使用无菌水冲洗至少五次，放入无菌培养皿中，在干净的工作台中采用一定的技术将枣果表面水分吹干。使用无菌解剖刀将病斑分成三层，即表皮层、表皮与果肉连接层和果肉层，放在PDA平板培养基上，在温度为25oC培养箱中培养[1]。
（2）组织块分离法：将病果用清水处理干净，然后在无菌操作台中使用浓度为70%的酒精对枣果进行擦拭，利用无菌解剖刀将病斑周围健康部分进行斜切，使用无菌镊子沿切口撕开，之后用另一把灭菌镊子将病健周围处果肉放在PDA平板培养基中，每个培养基大约放置3块组织块，共分离600个组织块。将其接种在PDA培养基上，在温度为25oC的恒温保温箱中培养5天后，对菌落进行检查，并且相关工作人员需要详细记载分离物分类。
（3）划线分离法：将分离出的真菌菌落培养产生孢子，使用接种针将不同状态的病原真菌的孢子和菌丝挑出，并在PDA平板行化线，将其放置在其中[2]。反复划线分离3次作用，将不同单菌落菌株进行纯化。不容易纯化的菌株则需要使用稀释平板法进行单孢纯化。
1.3病原菌的形态鉴定
1.3.1产孢表型培养观察分析
在大小为0.9cm的PDA平板中央放入大小为0.7cm的病菌菌苔，以斜插的方式将灭菌盖玻片放在距离病菌菌苔0.2cm～0.3cm处，然后在温度25oC培养箱中黑暗培养。待7天之后将盖玻片取出，将拥有菌丝的一面放在有无菌水的载玻片中，在光学显微镜下对产孢情况进行仔细观察。
1.3.2病原菌形态观察
将待试菌株放在PDA培养基平板中，在温度为25oC的黑暗环境中培养7天之后，对菌落形态进行仔细观察，并且通过显微镜对病菌分生孢子和分生孢子链形态观察其大小，并且进行详细的记载。同时，需要根据病原菌的产孢表型和在PDA培养基上的形态特点，对链格孢种的特点进行鉴定[3]。
1.4病原菌的分子鉴定
1.4.1菌种活化和菌体培养
将所有放在PDA平板上活化，然后在温度25oC黑白交替条件下进行培养，在培养5天之后，取菌落边缘3mmX3mm菌落，平放在一层玻璃纸PDA培养基中，在培养11天之后，进行DNA提取。
1.4.2采用试剂盒提出病原菌DNA
在温度28oC下，摇瓶培养菌株，从而可以收集菌丝体，使用去离子水对培养基和杂质进行冲洗，使用滤纸将水分吸干，使用液氮充将菌丝体研磨成为粉末，然后转入1.5mL的离心管中，采用真菌DNA提取试剂盒将基因组中的DNA提取，严格遵循试剂盒说明要求，之后使用浓度为0.1%的琼脂糖凝胶电泳检查DNA的同一性。
1.5病原菌纯化
在PDA培养基中培养5天～7天后，切取菌落边缘的菌落快5mmX5mm，放在灭菌载玻片中，加入100μL进行冲洗，将菌丝和孢子冲下，吸取悬浮液在水琼脂培养基上，然后使用无菌刮环均匀涂抹在皿中。将皿放在显微镜下进行观察和分析，并且标出单孢子，取出之后进行培养[4]。
2结果和分析
2.1病原菌的分离结果和形态特点分析
从大棚枣园基地采取冰糖枣、胎里红枣、中华梨枣三种分别分离15,22,132个菌株，分别选择具有代表性的菌株，设置编号菌株1，菌株2，菌株3[5]。菌株1在温度25oC PDA上培养7天之后菌落的直径在55.32mm～57.77mm，菌落边缘较为整齐，并且气生菌丝呈现薄絮状形态，开始前期阶段无色或者白色，后期阶段呈现灰褐色或者墨绿色；菌株2在温度25oC PDA上培养7天之后菌落的直径在64.22mm～69.32mm，菌落边缘较为平滑，初期呈现白色，后期呈现为墨绿色，中心位置常常伴有浅灰或者黑褐色同心轮纹；菌株3在温度25oC PDA上培养7天之后菌落的直径在68.33mm～71.62mm，菌落边缘呈现平滑状态，中心位置呈现向四周发散，初期白色或者无色，后期呈现墨绿色或者灰色。
2.2致病性测定
在枣果接种10天之后，通过刺伤处理接种菌株2、菌株3枣果平均发病率为62.33%和55.02%，发病情况与自然发病情况基本相同，病斑未能够在接种点，初期表现为发散状态蔓延，后期逐渐大块变红、萎缩。对接种发病之后的病斑再一次进行分离操作，可以获得与原分离菌株相同的病原菌，符合相关准则，由此可见接种菌是枣缩果病致病菌。
3讨论
枣缩果病通常是由病原微生物引发而成，其主要病原真菌为链格孢属病原菌，是一种半知菌亚门丝孢纲从梗孢目褐色菌科，是引发农作物致病菌之一。枣果存储期病原真鉴定方式通常会根据分生孢子的大小、形态、菌落情况等形态特点，并结合生理学进行相关的描述。但有些霉菌会形态特点会受到环境因素的影响而发生变化，同时绝大数的霉菌培养性状拥有很强的可变性，进而会使得霉菌分类标准不规范。因此，使用原有的形态鉴定霉菌存在一定的局限性。随着经济的快速发展，生物学技术的完善，ITS分子标记已经被越来越多的人熟知，并且被广泛应用在霉菌发育中，为真菌的系统发育和分类鉴定提供了一定的帮助和支持[6]。
参考文献
[1]李桂香,马璟,李春祎,赵海洲.枣缩果病发生规律及其防治[J].烟台果树,2019(04):41-42.
[2]王哲.枣缩果病的防控[J].农村新技术,2019(08):21-22.
[3]苟建新.枣缩果病病原形态鉴定及田间药效防治试验[J].中国园艺文摘,2018,34(03):65-67+73.
[4]柴东岩. 环境条件对枣缩果病的影响[N]. 河北科技报,2017-11-04(007).
[5]蒋丽煌,刘正兴,孙卫中,刘燕,帕热提·艾山,白剑宇.枣缩果病病原菌药剂筛选试验[J].农村科技,2015(07):36-38.
[6]柴高正.枣缩果病发病与雾、光照关系及防治[J].河北果树,2018(05):57.