摘 要 釆用聚丙烯酰胺电泳法（PAGE）,以T=7.5%、T=10%、T=13%、T=15%四种浓度不同的凝胶系统分离经Al3+、Cr6+处理过的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶，然后用两种染色配方进行染色比较，并进行酶谱分析。结果表明：1.在T=10%凝胶系统中菊芋PPO同工酶分离效果最好，共有10条酶带。2.在两种染色液配方中，配方一的染色效果较好。3.经Al3+处理过的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的酶活比没有处理过的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的酶活性低，说明Al3+对菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的活性有抑制作用。4.经Cr6+处理过的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的酶活与没有处理过的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的酶活相差不大，说明Cr6+对菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的活性抑制不明显。
关键词 菊芋 聚丙烯酰胺电泳法 多酚氧化酶同工酶 Al3+ Cr6+
0引言
菊芋，别名“鬼子姜”、“洋姜”，菊科（compositae）向日葵属植物，能形成地下块茎的多年生草本植物，学名为heianthustuberosusl,染色体数2N=102,六倍体物种。原产北美洲，经欧洲传入我国。现我国大多数地区都有栽培种植，是一种抗旱、抗风沙、耐寒、无病虫害、抗逆性强并具有广泛适应性的物种，植株高1-3米，根系发达，具有再生性强等特点[1]。 据相关资料报道菊芋用于治理沙漠但未广泛应用，菊芋能成为沙漠之星与它的生长特性有关，而它的生长特性与菊芋植物体内的酶系统有关。目前未见有太多关于菊芋多酚氧化酶（PPO）同工酶研究资料的报道。本文运用聚丙烯酰胺电泳及活性染色方法，对菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶酶谱进行分析，为寻找与菊芋特殊生命力有关的酶提供基础资料，并为菊芋能作为治理干旱地区的植物之一提供一些生理化指标。
1 材料与试剂
1.1 材料
实验材料 菊芋（菊芋的预处理：种植14盆菊芋幼苗，每2盆作为1个编号，分别编号1、2、3、4、5、6、7。其中1号为对照，只浇清水，不用作其他任何处理。用Al2（SO4）3分别配成浓度为50umol/L、100umol/L、200umol/L的溶液各适量，分别浇在2、3、4号植株中，每次各50ml,每隔3天浇一次，共要浇4次。用K2Cr2O7分别配成浓度为50umol/L、 100umol/L、200umol/L的溶液各适量，分别浇在5、6、7号植株中，每次各50ml,每隔3天浇一次，共要浇4 次。
1.2 药品
丙烯酰胺（Acr,广州医药站化学试剂公司）；N, N一甲双叉丙烯酰胺（Bis,Fluka）；
过硫酸胺（Ag,广东汕头新宁华工厂）；三羟基甲基氨基甲烷（Tris,成都化学试剂厂）；
氨基乙酸（Gly,广东汕头新宁华工厂）；四甲基乙二胺（TEMED,东京化成工业株式会社）；
分析纯盐酸；
染色药品：
邻苯二胺（O—phen,上海试剂总厂第三分厂）；对苯二胺（P—phen,上海五联化工厂）
邻苯二酚（Pyro,上海试剂总厂第三分厂）；草酸（Dxal,广东汕头西陇化工厂）
蔗糖（Sucr,广州化学试剂厂）；磷酸氢二钠（Diso,广东汕头西陇化工厂）
磷酸二氢钠（上海新华化工厂）
1.3 仪器
离心机（TGL—16型，上海医疗机器六厂）；电泳仪（702B型上海市医药公司）.
2. 方法
2.1 酶液的提取 参照[2]称取菊芋成熟叶子200mg,置于预冷的小研钵中，加 0.05mol/L Tris-HCL（PH=8.0）提取缓冲液1 ml，在冰浴中研磨成匀浆，然后冷冻离心（12000/min） 20min,弃沉淀，收集上清液为粗酶液并滴加10%蔗糖溶液2滴保存于冰箱中备用。
2.2 凝胶的制备 聚丙烯酰胺凝胶参照方法制备（凝胶配制系统见表1所示）
表1：电泳凝胶配制系[3]
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*配制体积比是指总体积为10ml,各种贮液的体积比例量
2.3 加样 用微量进样器上样。菊芋PPO同工酶用T=10%胶浓度进行电泳，每管上样量为60ul。电泳上样前酶液中加入1滴0.1%溴酚蓝混匀后上样。
2.4 电泳 开始电泳时采用稳压49V, 25min后,电压加大为149V,电泳在常温下进行，时间约需2.5h。
2.5 染色 当样品从（-）电泳到距（+）还有大概1厘米的时候，将凝胶用注射器吸取蒸馏水注射到玻璃管中，让凝胶从玻璃管中滑出，分别放到干净试管中，然后现配染色液，配染色液采用的染色配方有两种：
配方一：按0. 06%对苯二胺（用适量0.01M草酸溶解后再加蒸馏水混合）:1%邻苯二酚:0.05M磷酸缓冲液（PH=6.8）=1:6:1（V/V）配制[4]，将配好的染色液加入到各个试管中（染色液要浸过凝胶），待染色15—20分钟后观察酶带的出现，待酶带较为清晰的时候倒去染色液，加2%的醋酸浸泡，保存，拍照。
配方二：按0.06%邻苯二胺（用适量0.01M草酸溶解后再加蒸馅水混合）：1%邻苯二酚：0.05M磷酸缓冲液（PH=6.8）=1:6:1（V/V）配制[5]，将配好的染色液加入到各个试管中（染色液要浸过凝胶)，待染色15—20分钟后观察酶带的岀现，待酶带较为清晰的时候倒去染色液，加2%的醋酸浸泡，保存，拍照。
2.6 Al3+、Cr6+对菊芋处理后的菊芋PPO同工酶酶活性的测定
方法[6]：50 m mol/L的邻苯二酚(磷酸缓冲液，PH=6.5)为底物，加入适量的酶液，作用5分钟后测产物在420nm处的吸光度，直接用吸光度表示酶活大小。步骤：3ml酶液+5ul显色剂(邻苯二酚)，5分钟后测得A420的值。
3 结果与分析
3.1 菊芋PPO在不同凝胶浓度中和在不同染色配方中的电泳图谱
(1)菊芋PPO同工酶酶谱见图1所示，在T=7.5%、T=10%、T=13%、T=15% 四种不同胶浓度中分别见到9、10、8、7条PPO同工酶酶带。可见在T=15%分离胶中仅见7条PPO同工酶酶带，说明胶孔隙太小不能使分子量相近、形状相似的同工酶分开。在T=13%中胶孔隙比T=15%稍大，见到8条PPO同工酶酶带，比T=15%胶多一条带，在T=7.5%胶孔隙比T=13%更大，见到9条PPO同工酶带，比T=15%和T=13%分别多2条、1条。而在T=10%中见到PPO同工酶酶带共有10条，可知在此浓度中PPO同工酶酶带分辨率最高，分离效果最好。
(2)在图1中，Al、Bl、Cl、D1用的染色配方为染色配方一，染岀带数为9、10、8、7。在A2、B2、C2、D2中，染色配方为染色配方二，染出带数为 9、10、8、7。第二种配方相比于第一种染色配方，其染色酶带清晰度低于第一种染色配方，所以可知第一种染色配方染色效果较好。
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(+) A1 A2 B1 B2 C1 C2 D1 D2 A1 A2 B1 B2 C1 C2 D1 D2
模式图 电泳图谱
* A1、A2为浓度7.5%的凝胶 B1、B2为浓度10%的凝胶
C1、C2为浓度13%的凝胶 D1、D2为浓度15%的凝胶
图1菊芋PPO同工酶在不同胶浓度中电泳图谱
3.2 不同上样量的菊芋PPO电泳图谱
不同上样量的菊芋PPO电泳图谱如图2所示，其中A、B、C上样量分别为 50ul、60ul、70ul,经染色后A有9条酶带，B、C各有10条酶带，但其中B的酶带比C中的酶带较清晰，可知60ul的上样量使酶带分辨率最高，分离效果最好
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（+） A B C A B C
模式图 电泳图谱
图2 不同上样量的菊芋PPO电泳图谱 T=10% 上样量 A=50ul B=60ul C=70ul
3.3 Al3+、Cr6+对菊芋PPO同工酶酶活性的影响
由2.6的方法测得
表2：
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由表2的数据可知：受处理过的2、3、4号的PPO同工酶的酶活受到Al3+的影响酶活明显下降，受处理过的5、6、7号的PPO同工酶的酶活受到Cr6+的影响酶活变化不是很明显。
3.4 Al3+、Cr6+对菊芋中PPO同工酶电泳图谱的影响
(1)由图3可以知道：（1）当菊芋经Al3+处理过后，它的电泳图谱对照1号为10条酶带，2、3、4号的酶带数分别为9、8、7, 2号样比1号样少第P7条带，3号样比1号样少第P4、P7两条带，4号样比1号样少第P4、P6、P7三条带，带数是呈递减趋势，酶带颜色也逐渐变浅，酶带粗度相对变小，原因可能是随着 A13+的加入和浓度的增加，菊芋中的PPO及其同工酶的酶活性明显降低，同时说明Al3+对菊芋的生长影响较大，如果菊芋在生长环境中大量吸收Al3+,那么Al3+会抑制PPO及其同工酶的活性，大大降低菊芋的抗病性，不利于菊芋的生长。
(2)菊芋经Cr6+处理过后，它的电泳图谱5、6、7号的酶带数分别为9、10、9, 5号样比1号样少第P7条带，7号样比1号样少第P7条带，带数变化不大，酶带颜色变化不大，酶带粗度相差也不大。这表明Cr6+对菊芋的PPO及其同工酶的活性影响不是太明显，但大量吸收也会破坏菊芋PPO及其同工酶的抗病性，不利菊芋的生长。
(3)第P7条带受Al3+、Cr6+的影响最大，其敏感性最强。其次为P4、P6两条带。
(4)在七个样品中，它们的Pl、P2、P3三条带的颜色最深，说明它们的酶活力最大。
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图3 Al3+、Cr6+对菊芋幼苗PPO同工酶的影响
4 讨论
同工酶是指生物体内催化相同反应，但分子结构不同的一组酶。同工酶（蛋白质）在聚丙烯酰胺凝胶中电泳迁移率的不同能反映出它们在分子大小上的差异。大多数基因性同工酶（由不同基因产生的肽链而衍生的同工酶）常表现不同的生理功能，同工酶既可以作为生理指标，也可以作为可靠的遗传指标。我们可以根据同工酶谱的变化，用来鉴别生物类别及其亲缘关系。在生物学中，同工酶可用于研究组织分化、个体发育、遗传变异、物种进化、杂交育种等。
多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,简称PPO)是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称，是自然界分布极广的一种金属蛋白酶, 也是一类氧化还原酶。普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。目前科研人员已对多酚氧化酶与生物体抗病性之间的关系进行了大量的研究[7、8、9]。植物中的多酚氧化酶能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌类化合物进而发挥抗菌和驱赶捕食者的作用[10]。
4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳是让所分离的物质带上负电，然后根据所带的负电荷数的不同，分子量大小的不同，分子形状的不同，分子通过三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶因迁移率的不同从而分离出其中的同工酶。凝胶浓度的大小、PH的大小、电极缓冲液离子强度的高低都会对分离结果造成一定的影响，使电泳结果产生或多或少的误差。通过反复电泳实验探究和实验结果验证，需注意以下几方面：
(1)凝胶贮液使用前应过滤1~2次，便于除去药品中的杂质。
(2)凝胶贮液从冰箱中取出，应过20分钟以后再用，可以避免因热胀冷缩而在凝胶柱中形成气泡，影响实验结果。
(3)电泳时间应控制在2~3小时之间，时间过长，玻璃管发热，酶带扩散，出现拖尾。
(4)PPO宜在149V~200V低压电泳，电压过高，电泳时间过短，不利于分子量相近的同工酶分离。
4.2 在T=7.5%、T=10%、T=13%、T=15%四种不同凝胶系统中，T=10%的凝胶系统最适合菊芋中多酚氧化酶(PPO)同工酶的分离，其分离结果最清晰，效果最好。
4.3 在T=10%的凝胶系统中，上样量为60ul的分离效果最好，酶带最为清晰。
4.4 两种染色配方中，配方一的染色效果比配方二清晰。
4.5 经过Al3+处理过的菊芋中的PPO同工酶活性明显受到抑制，而经过Cr6+处理过的菊芋中的PPO同工酶活性影响不明显。其中第P7条带受Al3+、Cr6+的影响最大，其敏感性最强。其次为P4、P6两条带。在七个样品中，它们的P1、P2、P3三条带的颜色最深，说明它们的酶活力最大。
参考文献
［1］刘军政.对我国西部菊芋种植与土地荒漠化防治研究的探索.甘肃科技，2003, 19 (6)： -160-.
［2］周劲巧.保鲜剂对麝香石竹切花SOD和POD同工酶的影响.广西科学院学报，1997, 13 (2)： -5-.
［3］何忠效等主编《现代生物技术概论》.北京师范大学出版社.1999年5月第一次刷.-192-.
［4］李名君.茶树多酚氧化酶同工酶.中国茶叶，1980；(2) 15-20
［5］袁艺.侧耳（平菇）的酯酶、多酚氧化酶及POD同工酶电泳分析
［6］肖厚荣(中国科技大)，硫酸铜诱导烟草多酚氧化酶抗变性的研究[J］. 化学物理学报2004.17 (5)
［7］张建军等.小麦品种对梭条斑花叶病毒抗病特性的研究［J］.华中农业大学学报，1996, 17 (2)：35—39
［8］范燕萍等.鸭梨感染黑星病生理病变的研究［J］.华中农业大学学报，1996, 17 (1):37-41
［9］安德荣.植物的生化抗病性［J］.陕西农业科学，1993, (2)：34—35
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