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摘要：一个有效的转化系统的建立，使得在瑞氏木霉中进行同源和异源基因表达的研究成为可能。瑞氏木霉转化系统与其它丝状真菌转化系统基本相似，一般使用细菌来源的质粒构建的载体。
关键词：瑞氏木霉木糖；酶基因；
根据只有同时带有外源性木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因的重组酿酒酵母才能在以木糖为唯一碳源的选择性合成培养基上生长的特点，从瑞氏木霉RutC～30的eDNA表达文库中成功地筛选到瑞氏木霉木糖酵脱氢酶基因，并同时构建了能利用木糖地重组酿酒酵母。
一、瑞氏木霉木糖
木糖相对于葡萄糖、甘油和果糖等能被微生物优先利用的碳源而言为迟效碳源。某些细菌、酵母和丝状真菌能发酵木糖为乙醇，但原核与真核生物利用D-木糖起始代谢步骤不同。通常细菌是利用木糖异构酶经一步异构化反应将D-木糖转变为D-木酮糖，而酵母和真菌则是利用木糖还原酶（XR）和木糖醇脱氢酶（XDH）进行两步氧化还原反应来进行同样的生物转化过程。瑞氏木霉（Trichoderma reesei）是自然界中广泛分布的腐生性丝状真菌，传统地被应用于生产各种酶制剂，如纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、蛋白酶、脂肪酶等，其工业规模的生产工艺已比较成熟。在基因工程研究中，现已被作为宿主菌生产多种外源蛋白。瑞氏木霉具有降解纤维素与半纤维素的完全酶系。由于其具有木糖还原酶和木糖醇脱氢酶（XDH），所以能继续利用降解半纤维素所产生的木糖作为碳源与能源生长。对丝状真菌木糖代谢酶基因的表达，尚未在分子水平上进行过研究。对瑞氏木霉木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因的克隆成功，为在分子水平上研究该二基因的表达创造了条件。我们以瑞氏木霉进行木糖代谢的关键酶———木酶还原酶和木糖醇脱氢酶以及磷酸戊糖代谢途径的代表酶。
二、瑞氏木霉木糖代谢关键酶基因在不同碳源条件下的表达
1.重组蛋白的产生。瑞氏木霉遗传改造中，常利用启动子与终止序列构建转化载体，将欲表达的蛋白质结构基因插入启动子与终止子序列之间然后用重组片段转化丝状真菌原生质体。利用基因定位置换整合的方法，将该目的基因定位整合到染色体上，使其在强启动子控制下并利用的前导肤序列引导重组蛋白进行分泌性表达，生产所需的同源或异源蛋白。用此方法已成功地构建了多种能过量产生目的蛋白的丝状真菌工程菌株。在已克隆到瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的基础上，拟对瑞氏木霉进行菌株改造，通过基因定位置换整合，破坏其木糖醇脱氢酶基因，构建木糖醇生产菌。此项工作正在进行中。瑞氏木霉不仅具有适于蛋白生产的诸多优点，而且对人没有毒性，在产酶条件下也不产生真菌毒素和抗生素。经过基因工程手段改造的瑞氏木霉重组菌株在大规模工业生产中是安全无害的
2.克隆方法。早期分离瑞氏木霉的酶基因曾采用差异杂交法，分别用纤维素诱导条件下与非诱导条件下所提取的探针，与瑞氏木霉基因文库进行杂交，选择那些与前者产生强烈杂交而与后者不杂交的菌落，从中筛选到纤维素酶基因。
其它克隆基因的方法包括：遗传互补法，利用具有相应营养缺陷型遗传背景的酵母菌作宿主筛选所需的酶基因，等利用带有热敏感的合成酶）基因的酿酒酵母菌为宿主，分离了瑞氏木霉的 利用该法分离了瑞氏木霉的乙酞木聚糖醋酶基因；异源杂交法，利用其它真核生物相关的基因片段为探针对瑞氏木霉文库进行原位杂交筛选等；反求遗传学法，由纯化的酶蛋白得到部分氨基酸序列，由此设计并合成寡聚核昔酸混合物作为探针酶基因。这些方法对宿主菌的遗传背景或其它条件要求较高，方法繁琐，费时费力，耗资较高，而使基因克隆工作进展较慢，能够快速而有效地分离丝状真菌的酶基因。该法是利用了某些丝状真菌酶的基因能够在酵母启动子的控制下，在酵母细胞中表达的特点，根据灵敏而可信的酶活力直接对丝状真菌的基因进行平板分析和筛选当然，采用此方法的前提必须是该酶基因能够在酵母细胞中表达，并且有灵敏的检测方法。这种克隆丝状真菌酶基因的方法已被成功地用于分离瑞氏木霉的内切葡聚糖酶基因葡聚糖酶基因和木聚糖酶基因根据只有同时带有外源性木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因的重组酿酒酵母才能在以木糖为唯一碳源的选择性合成培养基仁生长的特点，从瑞氏木霉表达文库中成功地筛选到瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因，并同时构建了能利用木糖的重组酿酒酵母用传统的方法分离调节基因，通常需要对相关的目的蛋白有详尽的了解，或能够得到相应的调节突变株以进行突变互补实验，或需要了解其在启动子上的结合位点，然后采用一步杂交法去克隆活化蛋白。但在对设想的调节蛋白没有任何了解的情况下，这些方法都不能应用。在酵母遗传学和分子生物学发展的基础上，进一步发展了以酵母为基础的双载体克隆系统，以克隆木霉的纤维素酶调节基因。该方法的原理是：首先用酵母报道基因lH s3 与启动子相连后转化营养缺陷型酵母菌株，其上启动子由于是诱导型启动子，在没有启动子活化蛋白存在的情况下不能启动报道基因在酵母中的表达。然后用构建在酵母表达质粒上、在纤维素上生长的将转化子文库置不含组氨酸的培养基上筛选，则只有带有不 基因或带有编码启动子活化蛋白基因的菌株能够存活。用此方法，成功地筛选到两个活化蛋白基因。此方法原理不仅适用于分离真菌水解酶调节基因，也可应用于任何真核生物其它调节基因的分离。
3.用杂交法鉴定基因表达方法的探讨。应用系列杂交法对同一个酶系的若干个基因同时从转录水平上进行基因表达的研究，即研究基因在不同生长条件或生理状态下的表达情况，具有直接、简捷、一目了然的优点。但其前提是各种样品的条件需严格保持一致，方有可比性。这种方法是在定性水平上比较基因表达的相对强弱，很难做到定量。但对许多目的而言，能够在定性水平上检测系列酶系中各基因的表达情况，已能够满足其实验要求。本文杂交法鉴定了瑞氏木霉木糖代谢关键酶基因在不同碳源上的表达情况，检测结果与用酶学方法检测的结果是一致的。研究了半纤维素酶系的多个基因在不同碳源上的表达情况，证明了该方法的可行性。当然，影响基因表达的因素，从复制、转录、转录后加工到翻译水平都存在，而本方法只是在转录水平上进行基因表达的研究，但该研究结果能提供一些有益的信息。进一步将转录水平上的研究结果与其它水平上的研究结果相结合，相互佐证，有利于作出最后的判断。细胞对不同碳源的利用情况不同，因而在不同碳源中的生长速度显然是不一致的，结果必然影响总RNA 中的含量。我们掌握各培养物的收获时间均在对数期内，以及保证所利用的碳源在收获细胞时仍过量存在，并用同样量RNA 进行杂交，这样就避免了由于培养物进入生长平稳期或碳源耗尽所引起的错误判断，并如实地反映出各种所检测的mRNA 在总RNA 中的含量。我们在混合碳源培养基中加入双糖，而最终测到的双糖浓度是否由于长时间振荡培养过程中体积减少而造成的浓缩效应，或由于其它原因，尚不清楚。
葡萄糖在培养基中的存在阻遏该基因的表达。当葡萄糖耗尽以后，培养基中不存在任何诱导物的情况下，以一定的基础水平进行转录。相比较，基因在每种碳源上都是强表达。瑞氏木霉转醛醇酶基因在所有各种不同碳源上都得到强表达。证实瑞氏木霉在不同碳源上生长时，都需要磷酸戊碳糖途径的存在，以产生菌体代谢所需要的各种戊碳糖及其它中间代谢产物。
参考文献：
[1]汪天虹，高培基等。瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的分离和鉴定，生物工程学报，2017，14（3），320 ～325.