摘要：为筛选最适合长臀鮠精子超低温保存的冷冻保护剂，配制5种不同种类的精子稀释液，以7.5%DMSO（冻存剂为终浓度，下同）为精子冻存液，将精子分别保存于不同种类冷冻保护剂中，通过测定不同冷冻保护剂对精子激活率、快速运动时间和寿命的影响筛选适合长臀鮠精子超低温保存的最佳冷冻保护剂。结果显示，长臀鮠精子经过超低温保存2周后，精子活性均显著降低，活力均不到鲜精的一半。MPRS溶液作为稀释液保存效果最佳，其精子激活率、快速运动时间和寿命最高。研究表明，MPPRS溶液作为冷冻稀释液、7.5%DMSO为冻存液可以较好的超低温保存长臀鮠精子。
关键词：长臀鮠精子；超低温保存；冷冻保护剂筛选；活力检测
长臀鮠（Cranoglanis bouderius），属硬骨鱼纲（Osteichthyes）,鲇形目（Siluriformes）,长臀鮠科（Cranoglanididae）,长臀鮠属（Cranoglanis）。因为其经济价值极高，肉质鲜美，深受人们喜爱[1-2]。由于滥捕滥杀严重，导致长臀鮠资源已经枯竭。野生长臀鮠亲鱼雌雄个体性成熟不同步，繁殖成功率较低，因此进行人工繁殖显得尤为重要。目前对长臀鮠的相关研究主要集中在人工育种[3].，形态和结构特征研究[4-5].，饲料营养及消化等方面[6]，但效果甚微。本课题组在长臀鮠人工繁殖方面也曾进行大量研究，发现雌雄亲鱼性成熟不同步，严重制约长臀鮠繁殖成功率，因此通过储存优质且充足的精子建立长臀鮠精子保存库尤为重要，不仅可以解决人工繁殖雄性精液不足、雌雄不同步问题，而且避免了近亲繁殖，为后续开展人工繁殖、杂交育种及雌核发育等研究奠定基础。
有关鱼类精子冷冻保存的研究已有40多年的历史，国内外有关精子冷冻保存成功的报道有很多，如黄颡鱼（Pseudobagrus fulvidraco） [7-8]、长吻鮠（Leiocassis longirostris）[9]、大黄鱼（Pseudosciaena crocea）[10-11]、七带石斑鱼（Epinephelus lanceolatus）[12]等，但是有关长臀鮠精子超低温保存的研究未见报道。影响精子保存的主要因素为冷冻稀释液与冷冻保护液，前者为精子提供最佳的生理环境，常用的有MPRS、Hanks溶液等, 稀释比例一般在1︰1—1︰9[13]；后者主要保护精子防止冻伤，常用的抗冻剂种类主要有DMSO（二甲基亚砜）、Gly（甘油）及PG（丙二醇），其适用浓度一般为5%—20%[14]；采用的降温方法有程序降温仪降温法或自制简易降温装置降温法。评价精子保存的检测方法主要精子活力检测法（精子保存前后激活率、快速运动时间、寿命）、酶活性检测法、单细胞凝胶电泳（SCGE ）、DNA损伤检测法等[15]。根据预实验结果，并参考陈松林对黄颡鱼精子保存的实验设计[15]，摸索长臀鮠超低温保存最佳冷冻液为7.5%DMSO溶液，搭配不同种类稀释液，通过超低温保存方法，获得了活力较高的精子。
1 材料与方法
1.1 材料
性成熟珠江长臀鮠雄鱼于2017年5月取自清远市兴渔水产科技有限公司连江口鱼排，鱼体重1.5-2kg（n=5），体长0.3-0.5m，为5龄鱼，共60尾，经促黄体素释放激素类似物和绒毛膜促性腺激素（LRH-A+HCG）催产，24h后采精。
1.2 方法
1.2.1 精液的获取
选取生殖孔发红的成熟雄性亲鱼，擦干生殖孔及体表水分，用剪刀解剖腹部获取长臀鮠性腺。用镊子将精巢夹出，使用PH=6.4磷酸缓冲液轻轻冲洗精巢，转移至离心管中，用剪刀将精巢剪碎释放精子，镜检选取活力在 90% 以上的精子作为实验材料，1000r/min离心4min，取得白色精子沉淀，4 ℃保存备用。
1.2.2 精子活力的观察
以蒸馏水为激活液，精液与激活液混合后在显微镜下观察精子活力（激活率、快速运动时间和寿命）。激活率指视野中被激活的精子数量占全部精子数量的百分比；快速运动时间指90%精子形态和运动路线模糊前的时间；精子寿命指精子被激活至90%以上精子停止运动的时间，每个实验重复三次。
1.2.3 稀释液种类对精子超低温冷冻保存效果的实验
以D15、Cortland、鱼用任式液、MPRS液为稀释液（表1），以7.5%DMSO为冻存液。先将精巢剪碎后与5种稀释液以1：6体积混匀，再加入等体积冻存液，4℃平衡30min，然后分装于2mL冻存管中，每管保存体积1.2mL，使用程序降温仪降温后投入液氮，保存2周后，从液氮中快速取出，立即37摄氏度水浴1min解冻，检测精子活力。本实验所用程序降温仪程序如下：1、4℃平衡20min。2、以每分钟1℃降到-15℃平衡1min。3、以每分钟2℃降到-50℃，平衡1min。4、以每分钟5℃降到-80℃保存。
1.2.4 数据分析
每个实验设计三个重复，实验所有数据均表示为平均数±标准差，采用SPASS 17.0软件对实验数据分析。数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA）检验各组精子活力差异显著性。相同字母表示差异不显著，不同字母代表差异显著，差异显著水平为P<0.05。
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2 结果
2.1 不同种类稀释液保存精子对精子激活率、快速运动时间、精子寿命的影响
本实验所用鲜精激活率平均为91.5%。将精子体外激活后观察精子快速运动时间和寿命分别为2.15 min和2.45 min。结果发现，精子经超低温保存后，其激活率、快速运动时间、精子寿命均显著低于鲜精，其精子最高激活率不到60%。其中MPRS溶液保存效果最佳，其精子激活率、快速运动时间和寿命最高，分别为（51.1 ± 1.31）%，（4.87 ± 0.29）min和（5.67± 0.44）min。其次为Hank’s溶液，精子激活率也达到了（48.23 ± 0.87）%。保存效果最差的为D15溶液，其精子激活率、快速运动时间和寿命仅为（7.57 ± 0.87）%，（2.73± 0.15）min和（3.5 ± 0.21）min。综上所述，MPRS溶液为长臀鮠超低温保存适宜的稀释液。
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图一 不同稀释液超低温保存后精子激活率、快速运动时间和寿命
（a）、（b）分别代表不同稀释液超低温保存精子后精子激活率、快速运动时间和寿命的影响
3 讨论
3.1 超低温冷冻保存对长臀鮠精子激活率、快速运动时间、寿命的影响
超低温冷冻保存技术广泛应用于鱼类精子保存研究，主要应用液氮的超低温功能抑制精子细胞能量的消耗与酶活力变化[16-17]。鱼类精子在超低温保存中由于营养消耗、代谢产物积累、冰晶损伤等原因会逐渐丧失活力[18-19]，通过配制合适冷冻保护剂来维持其良好的生理状态抵御外界不良条件对精子的损伤[20-21]。精子对于冷冻保护剂的选择具有物种特异性，个体间也存在差异[15]。通过参考鱼类、贝类等精子常用精子冷冻保护剂，以7.5%DMSO为冻存液，配制了5种稀释液，进行超低温保存，筛选长臀鮠最佳冷冻稀释液和冻存液。实验结果表明，MPRS溶液做为长臀鮠精子超低温保存的稀释液可以较好地保存长臀鮠精子，其精子激活率、快速运动时间和寿命最高，分别为（51.1 ± 1.31）%，（4.87 ± 0.29）min和（5.67 ± 0.44）min。推其原因是该保护剂提供了精子细胞良好的生理环境，不仅提供其代谢所需能量，而且避免精子细胞在保存过程中的损伤，有效保护了精子的生存。有研究表明，精子细胞超低温保存过程中膜脂成分的变化是影响精子保存的重要因素，精子活力的高低与膜脂的磷脂酰乙醇胺（PE）的含量成正相关[22]。虽然任式液与D-15溶液被广泛应用作淡水鱼类的精子稀释液，但在本实验中，保存效果不佳，推其原因是溶液成分不能满足精子生理需要，改变了精子细胞脂膜成分，导致PE含量降低，破坏了精子活性。
参考文献
[1] 吴小明, 周立斌, 曾小丽. 珠江长臀鮠含肉率及肌肉营养成分分析[J]. 水生态学杂志, 2010(04):131-134.
[2] 尤洋, 周彦锋, 徐东坡, 等. 海南长臀鮠肌肉营养品质分析[J]. 中国农学通报, 2011(07):374-379.
[3] 吴土金, 钟良明, 谷平华, 等. 长臀鮠大规格苗种培育和成鱼养殖技术研究[J]. 水产养殖, 2016(08):23-24.
[4] 杨家坚. 海南长臀鮠人工繁殖与胚胎发育的研究[J]. 上海水产大学学报, 2008(06):684-688.
[5] 周利, 周路, 张竹青, 等. 红水河长臀鮠的形态生物学研究[J]. 贵州农业科学, 2011(04):157-159.
[6] 吕子君, 陈平原, 李正光, 等. 螺旋藻对海南长臀鮠抗氧化和脂代谢指标的影响[J]. 饲料工业, 2015(14):24-27.
[7] 汪亚媛, 张国松, 李丽, 等. 瓦氏黄颡鱼精子的生理特性及其超低温冷冻保存的初步研究[J]. 海洋渔业, 2014(01):29-34.
[8] 夏良萍, 陈梦婷, 陈悦萍, 等. 黄颡鱼精子超低温冷冻保存技术[J]. 江苏农业科学, 2013(10):196-198.
[9] 万全, 沈保平, 孙文贤，等. 长吻鮠精子保存液在人工授精中的应用试验[J]. 水产养殖, 2006, 27(3):4-6.
[10] 程顺, 闫家强, 竺俊全, 等. 大黄鱼(Pseudosciaena crocea)精子冷冻前后的活力及超微结构变化[J]. 海洋与湖沼, 2013(01):56-61.
[11] 姜建湖, 闫家强, 竺俊全, 等. 大黄鱼精子的超低温冻存及细胞结构损伤的检测[J]. 农业生物技术学报, 2011(04):725-733.
[12] 姜静, 田永胜, 翟介明, 等. 超低温冷冻保存对七带石斑鱼胚胎酶活性的影响[J]. 农业生物技术学报, 2014(04):476-485.
[13] Fan B, Liu X C, Meng Z N, et al. Cryopreservation of giant grouper Epinephelus lanceolatus (Bloch, 1790) sperm[J]. Journal of Applied Ichthyology, 2014, 30(2):334-339.
[14] 郝忱, 严维辉, 丁淑燕, 等. 鱼类精子超低温冷冻保存技术及其应用[J]. 水产养殖, 2014(07):48-52.
[15] 陈松林. 鱼类精子和胚胎冷冻保存理论与技术[M]. 中国农业出版社, 2007.
[16] Chao L P, Birkbeck T H. Storage of marine fish erythrocytes in liquid nitrogen[J]. Journal of Fish Biology, 1978,13(4):483-488.
[17] 赵维信, 姜仁良. 淡水养殖鱼类胚胎低温保存的初步研究[J]. 水产科技情报, 1991(3):68-71.
[18] 舒德斌, 郭柏福, 万建义, 等. 匙吻鲟精子超低温冷冻保存试验[J]. 水产科学, 2013(06):353-356.
[19] 闫秀明, 张小雪. 超低温冷冻对黄鳝精子中几种酶活性的影响[J]. 水生生物学报, 2011,35(5):882-886.
[20] Cabrita E, Sarasquete C, Martínez-Páramo S,et al.. Cryopreservation of fish sperm: applications and perspectives[J]. Journal of Applied Ichthyology, 2010,26(5):623-635.
[21] 采克俊, 曹访, 叶金云. 鱼类精子低温冷冻保存研究进展[J]. 湖州师范学院学报, 2012(02):26-30.
[22] 吕刚, 刘静, 王芳, 等. 鱼类精子膜脂检测方法的建立及其膜脂在精子超低温冷冻中的作用: 全国低温生物医学及器械学术大会, 2010[C].