摘要：在显微操作中,显微操作针是不可缺少的工具，其质量直接对操作的效果造成影响。文章重点对显微操作中(体细胞移植、胞质内单精子注射等)使用的针头类型进行了分析，并介绍了相应操作针的制作方法、注意事项等，以提高显微操作针的制作质量。
关键词：核移植；单精子注射；显微；操作针
1.仪器设备、材料
拉针仪器为Narishige，其型号是PN-3，其参数依次为Heater、Magnet、Main Magnet；断针仪器为H.saur，其型号是D-72770；针磨仪器为Narishige，其型号是EG-400；毛细玻璃管是Borosilicate。
2.制针用-毛细玻璃管的准备工作要点
在采购硅化的毛细管玻璃管时，应检验其是否已灭菌，通常国产的毛细管仅经酒精浸泡处理，并且包装非常简单，需要进行以下处理：为了去除毛细玻璃管壁的杂物，可以将其浸泡在4％HCl中24小时，并经自来水进行冲洗，使其保持中性状态，在浸泡在去离子水中半小时，烘干，然后将其浸泡在75％的酒精中24小时，在使用去离子水进行冲洗烘干处理，最后经包装后在160℃的干烤2.5个小时，以达到彻底灭菌。
3.显微操作针的制作
3.1固定针的制作
固定针用于固定卵母细胞，它必须牢固并且不会损坏卵子。因此，固定针的形状和内径至关重要，尖端应光滑，内径不应太大或太小。如果内径过大，卵母细胞很容易被吸入管中；如果内径过小，则卵子在显微操作时很容易旋转，增加操作难度。如外径过大，则会导致固定针接触操作盘底部时，固定卵子的针嘴与底面距离过高，当在底部分离直径过小的卵母细胞时，易出现卵子旋转，并且会失去观察原核的最佳位置。一般固定针最佳的外径应为120至140um，内径应为25um，且侧面应保持对称、光滑。固定针的制作流程为：拉、断、烧、弯。
3.1.1拉针
在选择毛细玻璃管时，应选择外径、内径、长度分别为1mm、0.58mm、长150mm的后壁毛细管。首先用手将毛细管两端固定，在中间位置用自制小酒精灯加热并旋转，使其变软后将其拉伸至1厘米，迅速从加热处退出，同时将玻璃管拉长；另外，也可以使用更合适的拉针器，具体参数为4.5、10、10，但是用此方法制作的针具有较大斜坡。断针时，需要在适当的位置进行一次断针操作，后续没有改动空间，会造成大量浪费，一般不推荐使用。
3.1.2断针
左手握针，右食指和中指用来夹医用小砂轮。在合适位置触摸砂轮边缘，对玻璃管转动一圈，然后用拇指轻轻按一下尖端，针会断裂，并保持尖端光滑。如若断口不光滑，因为用手拉的针比较长，可以继续进行折断，直到尖端光滑、口径对称为止，运用此方法需要丰富的经验。同时，可以通过对断针仪进行使用，来进行断针操作，利用毛细管在铂丝弯头的中点烧制一个小玻璃珠，并在断针仪上水平安装针，将玻璃珠移至约100um位置处，使玻璃珠刚好与针头接触，打开开关小火加热，这时，由于温度的变化，玻璃珠会移动至针尾，如玻璃珠慢慢变红停止移动时，毛细管会与玻璃珠接触融合，然后将加热开关关闭，随着温度突然下降，玻璃珠马上收缩，针马上被拉断，此方法折断的针具备口径光滑的优点，但由于卵针直径过大，容易出现铂丝拉断问题，通常很少使用。
3.1.3烧口
用断针仪玻璃珠接触断针的嘴，以使二者位于相同水平面，相隔较大距离并逐渐加热。当玻璃珠变成红色并停止移动时，停止加热操作，并朝玻璃珠方向慢慢移动针，针直径会越来越小，当口径小于等于25um时，将加热开关关闭。
3.1.4烤弯
在断针仪上将针头垂直固定，并与玻璃珠保持4mm的距离接触，以确保它们在同一水平面上，两者相隔很远时，打开开关缓慢加热，在玻璃珠颜色为红色时，停止加热操作，玻璃珠移到靠近针位置时，针尖朝玻璃珠的方向逐步弯曲，用左手对旋钮调节，使玻璃珠略微向上移动，用右手拿不用的玻璃管将针尖朝玻璃珠轻轻按压，角度为30°时，将加热开关关闭，以免出现针内径融合问题。使用时，为了确保针尖接触操作盘底部，需要在与针中部的第一弯头平行方向上烤第二弯头，即使其成为倒Z形。
3.2去核针的制作
透明带切口去核指的是用去核针挑破透明带，从破裂透明带位置挤出核，此方法要求去核针尖端较细，但细的位置不宜过长，基部应较厚，方便挤压。一般厚壁毛细管的参数应为8、2、8最佳，抽出的针头细处长度约为1.5毫米，针尖与针头肩部之间的距离小于5毫米，拔出针后，将其直接烤至弯曲，方法与固定针一致。
3.3移核针的制作
移核针作用是对体细胞进行储存，体细胞通过透明胶带上的切口在透明胶带下方移动。因此，不需拉出尖端，但是针前端用于储存体细胞的部分对内径、长度要求要合理，内径过大过小都不利于操作。制作移核针的过程为拉、断、烤。除了玻璃管的外径、内径、长度依次为1mm、0.75mm、150 mm的薄壁毛细管外，该方法与固定针较为相似。拉针的参数分别为7.5、8和10。在操作中，由于移核针较细，加热速度应放缓，否则容易出现针熔化。
3.4盲吸法去核针的制作
盲吸法核移植针用的玻璃管及操作要求与移核针基本一样，但盲吸法是直接穿越透明带挤出核，然后在透明带下方移入体细胞。所以对针尖要求较高，且口径还需要维持不变，以避免将体细胞挤坏，制作流程为：拉-断-烧-磨-洗-拔尖。
3.4.1拉、断、弯
使用薄壁毛细管，其外径、内径、长度分别为1mm、0.75mm、150mm。拉-断-烤弯和移核针一样，但是在烤弯折后，需要在针尾部和弯头相方向上进行标记，从而使操作更加容易，拉针参数为5、9和9。
3.4.2磨
在磨针仪上固定标记好的针，将角度调整至40°，使标记点位于上方，旋转90°，对持针器提升杆调整，使针尖端刚好接触磨石平面，针之间阴影重合，如没有重叠，需继续调整针的角度直到重叠。研磨针有两种方法，一种是加水磨，在磨针仪器的注射器中加入适量水，慢慢向磨石加水，使水柱在针中保持特定位置，一般磨好一根约5分钟即可。另一种是不加水研磨：在放下针头之前稍微调整磨仪器的角度，，使针的尖端轻轻将研磨面按到一个小角度，以使磨针速度提高，一般磨好一根需3分左右。
3.4.3洗
由于经研磨的针内外都存在玻璃碎片，需进行清洁。使用一段连接到注射器的塑料管，其内径略大于针管的外径，以连接到针，用5％的氢氟酸对针尖外壁进行清洗（由注射器对针进行打气）30秒钟，然后将针连接到另一个装有MillQ水的试管中，并重复清洗几次，在清洁时，可以通过注射器打出的气泡大小对针内径进行粗略判断。
3.4.4拔尖
拔尖与断针相同，如果温度过高，则针口容易收缩，尖拔过长，在显微操作中很容易折断针尖且会损害胞质；如果温度太低，则不能顺利拔出针尖，在熔针仪上将经处理成斜角的针水平固定，尖端接触铂丝上的玻璃珠并慢慢加热，当针尖和玻璃珠慢慢融合时，迅速拉出玻璃珠，这样可在毛细玻璃管尖端形成一个短而尖的尖端，针的边缘光滑度也较好，这种针头可以很好完成透明带刺破工作，且不易损坏卵膜。
3.5胞质内单精注射（ICSI）针的制作
ICSI的操作没有核移植繁琐，但对针细度提出了较高要求。如果针太细，不仅不能顺利将精子吸入针内，而且针易出现抖动；针太粗，易将PVP液体携带进卵母细胞，导致后期培养难度较大，因此，要求针的口径只能容纳精子头。 ICSI针的制作流程为：拉-断-烤-磨-洗-拔尖；毛细玻璃管内壁外径、内径、长度分别为1mm、0.5mm、150mm的厚壁毛细管。但要注意由于ICSI针很细且容易出现熔化，所以在断针过程中通常不加热，只需将针尖轻轻触碰玻璃珠即可完成断针操作，因需将其磨成斜角，则无需关注口径光滑度；在烤弯时应慢慢加热，拉针参数为5、9和8.5。
4.显微操作针的保存
制作好的针需要存储在经75%乙醇清洗的容器中，并在使用前使用紫外线灯消毒45分钟。
结束语
显微操作过程比较繁琐，且对技术的要求较高，如果操作不当，则会导致试验以失败告终，因此，在显微操作中，必须做好显微操作针的制作，以提高实验成功的几率。
参考文献：
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