摘要：在显微操作中，显微操作针是非常关键的操作工具，其制作质量直接对操作的效果造成严重影响。文章重点对显微操作针的清洗、硅化、拉制、锻造中存在的问题进行了分析，并着重介绍了持卵针、注射针的整个制作流程及制作方案，以提高显微操作针制作的质量，为后续的实验操作奠定基础。
关键词：显微；操作针；制作
1.准备用于制作显微操作针的玻璃管
由于显微操作仪的制造商不一样，成品针的口径也存在较大差异，外径尺寸有1.0、1.5mm等。目前，国内使用的大多数玻璃管都是由日本等国外企业制造，其外径大约为1.0毫米，壁厚为0.02至0.15mm之间。由于显微操作仪型号不同，其操作方法也存在较大差异，因此要求显微操作针必须与操作仪匹配，才能确保实验效果。
由于玻璃管的制造商不同，该处理流程也存在较大差异。一般，从国外进口的玻璃管是硅化玻璃管，可以直接拉制成显微操作针。而由国内制造商生产的玻璃管仅使用浓度为75％的酒精进行消毒处理，并未进行硅化处理，因此，如果选用国产玻璃管，必须对其提前进行清洁和硅化，在投入使用。硅化玻璃管的流程如下，首先，用超声波清洗机将玻璃管清洗15分钟；其次，放置进干燥箱经干燥并浸酸处理取出，用流动的水清洗并干燥，再硅化5分钟并二次干燥处理；最后高压待用。根据用途将其可分为两种尺寸的显微操作针，即注射针和持卵针；注射针一般外径、内径分别为1.0毫米、0.8毫米；持卵针一般外径、内径分别为1.0毫米、0.6毫米。
2.显微操作针的拉制
一般，通常使用日本生产的PN-30水平拉针仪制作不同类型的显微操作针。此拉针仪的铂丝分为两种：即粗铂金和细铂金。在对持卵针进行拉制时，通常使用粗铂金丝，但在对注射器进行拉制时，一般需要根据操作系统而定。如果使用系统为Piezo的压电式操作仪制作注射针，则要求针尖端细而长，在这种情况下可以使用细铂金丝，而如果使用系统为Leica手动操作系统制作注射针，则需要使用粗铂丝。铂金丝的表面应像“Ψ”形一样光滑，固定在拉针仪上的玻璃管应位于铂金丝“Ψ”的中心。这样就可以均匀的加热玻璃管，反之，注射针的针尖会旋转，针尖会出现弯曲，对使用效果造成影响。
一般，拉针仪的参数有三个，热度、主磁力、次磁力，在选择参数时，应结合制针要求而定。针尖的长度和内径由热度决定，热度越高，针尖相对越长，口径越细，数值通常在65到95范围内；针尖的口径由主磁力决定，磁力越大，针尖口径越细，该值通常控制在65到100范围内。针尖细部分的长度由次磁力决定，磁力越大，针尖相对越短。因此，需根据实际情况调节相应的拉针仪参数后，在拉针仪上固定玻璃管进行拉制，经拉制后的玻璃管作为针胚。
3.持卵针的制备
3.1.持卵针的锻针方法
3.1.1砂轮断针
在左手的手指上放置针胚，目视观察合适的断针位置，然后用右手稍微旋转砂轮以使其轻轻地折断。
3.1.2锻针仪锻针
使用日本产的煅针仪（MF-900），首先在物镜支架上垂直放置针胚，然后将电热丝和玻璃珠调整到50x目镜下的最清晰位置，并对针胚的位置目测调整，使其在玻璃珠的正上方；调整镜下的针胚，并向后移动玻璃珠，以避免接触针胚，将针胚的口径调整为80μm，此时，向前移动玻璃珠，当针胚与玻璃珠位于同一平面上（即玻璃珠和针胚接触的位置）时，将其温度调节至30°C，打开电源，并在约3秒钟后慢慢松开，针胚被拉断。由于这两种锻针方法各有优缺点：前者对电热丝的损坏率极低，断口平整度较高，但控制针的口径难度较大，仅能将其控制在特定范围内；后者可以严格控制针的口径，但很容易损坏改变玻璃珠形状，对锻针效果造成严重影响。影响效果的因素有两点：其一，如若电热丝直径过大，温度太高，则在锻针时很容易弯曲；如若使用的电热丝太细，很容易出现熔化；玻璃珠大小和锻针温度，可以结合以往经验进行调整，如玻璃珠太大，可以适当提高锻针温度或者适当提高加热玻璃珠的时间。
3.2持卵针口径的煅烧
在玻璃珠上方放置折断的持卵针，将温度调节到开关的刻度值50，并在管口缩小在所需内径时，停止加热操作。在操作中，要严格对持卵针的口径进行控制，如果太大，持卵时很容易吸入大部分卵母细胞，使其变形，导致极体的位置出现变化，对操作效果造成影响；反之，如果太小，母卵细胞会随意摆动，对操作速度和效果造成影响。
4.注射针的制备
4.1锻针
一般，有两个常用的操作系统，并且两个针的制造方式完全不同，但锻针制造方法与持卵针方法一样，但与锻针的口径又有很大区别。其中，Leica显微操作仪需要口径为20μm的注射针，Piezo压电操作仪需要使用口径为10μm的注射针。Piezo压电式操作仪对针口的要求为平口，但是Leica显微操作仪手动系统需要将注射针的前端磨尖、拔尖。
4.2.磨针
在日本制造型号为EG-400磨针仪上固定针头，角度设置为45°和50°之间，首先将速度调节为0，然后调节视野，再将注射针头调节至只需触摸磨石即可。其次，将速度调整为50，然后用滴管在磨石中加入适量75％的酒精，等注射针管中的酒精液面稳定后，迅速升起注射针，使用注射器吹出玻璃针中的液体。
4.3拔尖
在玻璃珠上方垂直放置磨好的针，并确保针尖的开口朝前，同时对视野进行调整，将加热温度调节到约25，踩在加热板上，缓慢将针移至与玻璃珠刚接触时，停一会儿，然后快速提起，形成一个小尖端。
5.烤弯
在制作完成持卵针和注射针后，必须将其烤弯，两种系统中使用的持卵针要求相同，烤弯角度大约为20°至30°左右。使用Piezo压电式操作仪制造的注射针，烤弯角度控制在15°至20°之间。烤弯方法：在物镜支架上水平放置制备好的持卵针和注射针，并对视野进行调节。在玻璃珠上方放置玻璃针，并使两者保持一定距离。将电热丝的温度调节为50，踩下踏板，将玻璃珠缓慢升至离玻璃针较近的位置，同时在镜中的刻度上观察，当达到设定角度时，立即松开踏板。而使用Leica显微操作仪手动制造的操作针也可以在酒精灯的作用下烤弯，将其烤成Z形。
6.显微操作针的评定标准
6.1注射针
制作的注射针长度为5-8厘米，以确保其具备合适的注射尖端。注射针尖端的直径不超过1mm为最佳，内径控制在10至12μm之间为最佳，且在光学显微镜下看不清楚，如果通过光学显微镜可以看到注射针尖的开口，则表明针尖直径太大。如果注射针开口过大，将很难穿透原核，在完成注射后会出现受精卵破裂问题；但是，若开口过小，则灰尘容易堵塞针尖，影响正常操作。因此，在选择针头口径时，必须进行试验对比选择；此外，还需要严格控制针尖的锥度，可以通过在距针尖固定距离处测量针头直径来估算，在离注射针尖端50μm处的直径应控制在10至15μm之间或更小。从注射针尖的肩到尖端距离控制在5-8毫米左右。相关研究表明最佳的距离为8mm。如若距离太小，注射针的肩部将导致针尖无法固定在注射小室的底部，从而对注射效果造成影响；如若针过长，则在穿过厚厚的矿物油层时，注射针头会出现不稳定，严重情况下还会弯曲，导致注射工作无法正常进行。
6.2持卵针
管尖端的外径与卵母细胞的直径之差不得大于10-30μm。管口中心和卵母细胞的中心应处于同一水平线，这样当对卵母细胞固定时，卵母细胞在垂直方向上不会发生运动。管口外径如果过大，将无法按要求固定卵母细胞。在固定之前，垂直方向的位置变化将会使极体位置发生变化。管口外径如果过小，则在去核过程中，卵母细胞会出现摆动，对正常操作造成影响，因此，将持卵针的内径开口设置在中间最合理，为此，断头必须保持齐平。固定针的理想形状是外径为100至120μm，内径为10至20μm，且保证两侧对称光滑。
结束语
由于在显微操作中，显微操作针是不可缺少的工具，因此，只有不断对显微操作针制作中存在的问题和制作流程进行优化，才能最大限度保障显微操作针的制作质量，为后续的实验工作奠定基础。
参考文献：
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