通讯作者：代巧妹
【摘要】目的：研究分析窖蛋白1(Caveolin-1 Cav-1）基因与肺腺癌能量代谢的关系。方法：分析姜黄素对肺腺癌组织中细胞色素C氧化合成酶2（synthesis of cytochrom coxidase2 SCO2）、Cav-1进行处理，分析结果。结果：姜黄素对于SCO2以及Cav-1等具有明显抑制作用，当姜黄素与Cav-1 siRNA同时处理A549细胞时，对于Cav-1和SCO2抑制情况更加明显。结论：Cav-1可能通过调控SCO2的表达来影响肿瘤能量代谢。
[关键词]肺腺癌；Cav-1；姜黄素；SCO2
近年来我国肺癌的发病率呈现明显的上升趋势，其中非小细胞癌的发生率达到80%以上，而肺腺癌的占比为40%[1]，因此该疾病的临床研究成为热点。Cav-1是包膜窖主要成分，其通过脚手架结构域与一些重要的分子信号互相作用，从而影响肿瘤细胞生长以及转移等过程。此外Cav-1还能通过调节肿瘤细胞的代谢影响肿瘤发展，而其在肺腺癌能量代谢中的作用为本次研究重点。
1.资料与方法
1.1材料
人肺癌细胞系A549、SPC-A-1；试剂主要包括RPMI-640培养基、胎牛血清、姜黄素、DMSO、BAS、ECL、SCO2兔多克隆抗体、Cav-1兔多克隆抗体以及无水乙醇等。仪器主要为恒温水浴锅、高速冷冻离心机、pH计、酶标仪、PCR、CO2培养箱等。
1.2试验方法
1.2.1细胞培养
A549和SPC-A-1培养基含有1%双抗、10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，并在5%CO2的37℃保温箱中孵化。
1.2.2细胞复苏
超净台使用之外照射30min，水浴锅温度调节至37℃，将5mL培养基进行离心处理，离心后获取细胞混悬液，加入T25细胞培养瓶中，置于37℃中培养。然后进行细胞的传代处理，并将细胞进行冻存，血清：培养基：DSMO按照6:3:1进行冻存，然后室温放置。
1.2.3MTT法检测姜黄素对于细胞活性影响
取对数生长期的A549和SPC-A-1细胞，制备成细胞混悬液，调节好浓度，按照100uL孔接种到96孔培养板中，并设置4个复孔。96孔培养板置于温箱，细胞壁贴合好后将旧的培养基除去，加入不同浓度的姜黄素，每隔孔加入100uL，设置对照孔（细胞，完全培养，MTT，DMSO），并调节零孔。药物处理24和48小时，每孔加入5mg/ml的20uLMTT,继续培养。培养3小时后将培养基除去，每孔加入150uL DMSO,摇晃后再酶标仪下570mm波长处测定吸光度值，计算细胞活力。
1.2.4免疫荧光检测Cav-1 SCO2和TIGAR在肺腺癌中的表达
细胞接种在12孔板中，使用40uM姜黄素处理24小时，而对照组使用DMSO处理。24小时后将原培养基吸去，并使用PBS冲洗3次；之后使用4%多聚甲醛室温固定15min，并使用PBS冲洗，5%BSA溶液下37℃中密封1小时；将密封液丢弃，加入2%BSA稀释一抗溶液，4℃下孵化过夜，温度恢复后，将一抗液丢弃，PBS冲洗6次，避光后使用山羊抗兔荧光经二抗，并在37℃下孵化1小时，将二抗丢弃，PBS冲洗6次，DAPI染片，荧光显微镜下观察细胞形态。
1.2.5qpCR检测肺腺癌细胞中CAV-1、SCO2和TIGARmRNA表达
首先将细胞中的总RNA进行提取，然后检测RNA浓度，分析逆转录，并在荧光见定量PCR检测。而Western blot检测蛋白表达试验中，首先也是提取细胞总蛋白，然后BCA法检测蛋白浓度。
1.3数据分析
相关数据纳入统计学分析软件SPSS20.0中分析，组间数据比较后P＜0.05为差异具有统计学意义。
2.结果
2.1姜黄素抑制A549和SPC-A-1细胞活力
0-80uM的姜黄素对A549和SPC-A-1细胞处理24和48小时后，以上两种细胞生长速度明显降低，并且随着姜黄素浓度增加以及处理时间延长，细胞活力显著性下降。
2.2姜黄素对肺腺癌Cav-1代谢相关蛋白影响
对SPC-A-1细胞进行40um姜黄素处理0h、3h、6h、12h、24h，WB试验下发现，随着药物处理时间延长，Cav-1显著下调，与对照组比较6小时后差异显著（P＜0.05）；在A540细胞中，与对照组比较，随着姜黄素药物浓度的增加，Cav-1、SCO2蛋白表达下降，药物浓度达到20uM时差异显著（P＜0.05），但是与对照组比较差异不显著（P＞0.05）。
2.3Cav-1表达下调对糖代谢相关蛋白以及cyclinD1影响
使用WB检测对照组，siRNA干扰，siRNA干扰+姜黄素处理，以及姜黄素单独处理SCO2和cyclinD1蛋白表达影响，结果显示与对照组比较，Cav-1 siRNA和姜黄素均显著下调Cav-1蛋白表达，SCO2也随着Cav-1下调而下调。
3.讨论
Cav-1表达与细胞糖酵解和氧化磷酸化过程有关，Cav-1和p53也具有一定的关联，并且在p53细胞代谢中发挥直接作用，通过调节SCO2促进氧化磷酸化和TIGAR抑制糖酵解来实现[2]。本次试验研究中，姜黄素处理SPC-A-1细胞进行不同时间处理是，p53和SCO2和TIGAR变化差异显著，可能是p53没有调节SCO2和TIGAR表达；姜黄素以相同浓度对SPC-A-1细胞处理时间延长，Cav-1和cyclinD1显著下调，但是姜黄素不同浓度处理肺腺癌细胞24小时后，姜黄素可下调A549、SPC-A-1细胞中的Cav-1表达，对两种细胞p53影响不大，但显著降低A549和SCO2表达，以上结果显示姜黄素不是通过p53调节信号影响细胞代谢的。此外本次研究中我们发现姜黄素能够下调A549、SPC-A-1细胞中的Cav-1表达，并且为浓度依赖，说明Cav-1与糖代谢密切相关，此后实验中显示Cav-1下调会影响SCO2蛋白的表达。因此将以上分析我们认为Cav-1可能通过调控SCO2的表达来影响肿瘤能量代谢。
参考文献
[1]0rimo A．Welnberg R A SfromaI fibrob Jasfs in cancer：a noveI mor—promoflng ce||type[J]Ce||CycIe，2006．5(1 5)：1 597—1 601.
[2]陈福春,潘琦,傅品，等.肺腺癌组织中基质窖蛋白-1 和LDH-B、PKMJ2的表达及其意义[J].中国病理生理杂志，2017,27（3）：488-493.