【摘要】 目的 阐明粉防己碱对人多形性脑神经胶质瘤GBM8401细胞运动的影响，并明确其作用的分子生物学机制。方法 建立粉防己碱实验组、EGFR阻断剂组和对照组。Transwell细胞迁移实验检测各组GBM8401细胞迁移数目变化；ELISA检测各组细胞L-selectin、IL-8、NF-κB和p-NF-κB蛋白的含量。结果 与对照组相比，粉防己碱实验组GBM8401细胞迁移数目明显降低；与粉防己碱实验组相比，EGFR阻断剂组GBM8401细胞迁移数目显著升高。与对照组相比，粉防己碱实验组细胞L-selectin、IL-8、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达显著降低；与粉防己碱实验组相比，EGFR阻滞剂组GBM8401细胞L-selectin、IL-8、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达增加。结论 粉防己碱下调GBM8401细胞内L-selectin、IL-8、NF-κB蛋白表达而抑制GBM8401细胞迁移。
【关键词】粉防己碱；人多形性脑神经胶质瘤；细胞迁移
据世界卫生组织（World health organization, WHO）统计：2018年确诊的新增脑部恶性肿瘤患者至少30万，因脑部恶性肿瘤而导致每年死亡的患者高达约24万[1]。全世界每年投入大量资源探讨恶性肿瘤成因，积极寻找战胜恶性肿瘤的方法，但是收效并不显著。
粉防己碱（Tetrandirne, TET）具有抑制血管新生、抗炎抑菌等多种药理学活性[2]。能下调表皮生长因子（Epidermal growth factor, EGF），抑制增生性瘢痕组织成纤维细胞生长或血小板源生长因子（Platelet derived growth factor, PDGF）诱导的肝星状细胞增殖以及肺纤维化进程[2,3]。粉防己碱还能够减少表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor, EGFR）磷酸化以及核因子-κB（Nuclear factor-kappa B, NF-κB）的表达而抑制结肠癌、乳腺癌细胞的侵袭[4,5]。粉防己碱对脑神经胶质瘤GBM8401细胞运动的影响以及机制研究还不清楚。本研究观察高低浓度粉防己碱对人多型性脑神经胶质瘤GBM8401细胞运动的影响，并利用EGFR阻断剂证实粉防己碱与NF-κB信号通路的关系。研究结果对利用天然药物治疗或延缓人多型性脑神经胶质瘤等中枢神经系统恶性肿瘤发展，探寻靶向抗肿瘤的天然疗法具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 细胞 人GBM8401细胞癌细胞购自美国ATCC公司。
1.2 试剂 粉防己碱购自于美国Sigma-Aldrich公司；胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）、青链霉素和RPMI 1640培养基均购自美国Hyclone公司；人L-selectin、IL-8、NF-κB、p-NF-κB的ELISA试剂盒是美国R&D公司产品。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养 10%FBS、100U/mL青霉素与100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基培养GBM8401细胞。
1.3.2 细胞分组 37℃，5%CO2环境下，无任何刺激的GBM8401细胞为对照组；使用15μmol/L粉防己碱刺激GBM8401细胞为实验组；若在实验组添加10nmol/L Gefitinib（EGFR阻断剂）则为EGFR阻断剂组。
1.3.3 Transwell细胞迁移实验 1.5×104 GBM8401细胞种于Transwell细胞小室中，下层24孔板内添加含1%FBS的1640培养基以及相应的试剂。37℃，5%CO2培养12h，棉签擦除Transwell细胞小室中GBM8401细胞，4%多聚甲醛浸泡Transwell细胞小室，室温下静止90min，0.01mmol/L PBS缓冲液冲洗；1%结晶紫染色，0.01mmol/l PBS清洗；倒置显微镜下随机选取每组的5个视野，IPP 6.0.1软件计算穿过Transwell小室膜的GBM8401数目[6]。
1.3.4 ELISA实验 6.5×105各组GBM8401细胞在4℃环境下，以含1mmol/L PMSF的细胞裂解液裂解，提取离心上清液。使用人L-selectin、IL-8、NF-κB、p-NF-κB的ELISA试剂盒检测离心上清液中各蛋白含量。正常对照组离心上清液为阴性对照。
1.4 统计学处理 使用SPSS 21.0软件进行数据处理，结果以±s表示，数据进行方差检验，组间比较进行Q检验。P＜0.05被认为具有统计学意义。
2 结果
2.1 粉防己碱对GBM8401细胞迁移的影响
发现对照组、实验组、EGFR阻断剂组GBM8401细胞12h迁移数目分别为5214.43±12.57个、3058.12±15.54个、4735.28±18.36个，3组GBM8401细胞迁移数目相比，均具有显著性差异（F=75741.60，P=0.0001）。
2.2 粉防己碱对GBM8401细胞L-selectin、IL-8、NF-κB、p- NF-κB蛋白表达的影响
对照组、实验组、EGFR阻断剂组GBM8401细胞L-selectin蛋白分别为：12.71±0.07μg/ml、5.85±0.17μg/ml、9.17±0.11μg/ml，3组数据相比具有显著性差异（F=15384.23，P＜0.01）。对照组、实验组、EGFR阻断剂组GBM8401细胞IL-8蛋白相对表达量分别为：8.35±0.04μg/ml、3.28±0.01μg/ml、7.96±0.04μg/ml，各组数据相比均具有显著性差异（F=25677.10，P＜0.01）。对照组、实验组、EGFR阻断剂组GBM8401细胞NF-κB、p-NF-κB蛋白含量具有显著差异（P＜0.01），如表1所示。
表1 ELISA检测各组GBM8401细胞NF-κB、p-NF-κB蛋白含量
*P＜0.01，与对照组相比；#P＜0.01，与EGFR阻断剂组相比。
3 讨论
本实验以Transwell细胞迁移实验检测GBM8401细胞株受TET处理12h的细胞侵袭数目变化，经过量化分析后可以更明显观察到，GBM8401细胞在TET处理12h后，TET组GBM8401细胞穿过Transwell小室膜的细胞数目明显降低，因此，我们认为TET抑制了GBM8401细胞转移与侵袭的能力。有研究显示TET具有明显抑制GBM8401细胞运动能力的活性。Zhang ZX[7]证明TET在抑制人肝癌转移中起着重要作用，并为TET在临床人肝细胞癌治疗中的应用提供了新的见解。Zhang ZX以细胞划痕实验和Transwell细胞小室迁移实验，评估受TET作用的人肝细胞癌细胞侵袭和迁移作用，免疫荧光和Western blot分析用于研究上皮-间质转化（Epithelial stromal transformation，EMT）相关蛋白的水平。结果发现TET能够通过阻止人肝细胞癌细胞EMT过程，抑制人肝细胞癌细胞侵袭和迁移。TET具有潜在诱导人肝细胞自噬的效应，TET抑制了人肝细胞癌细胞内Wnt/β-catenin信号途径的活性，降低了转移性肿瘤抗原-1（Metastatic tumor antigen-1，MTA-1）表达以调节癌细胞转移。ELISA检测到GBM8401细胞株经TET处理12h后，细胞L-selectin和IL-8蛋白均呈现减少趋势。进一步利用ELISA检测NF-κB蛋白的活性。观察到经TET处理12h后GBM8401细胞p-NF-κB蛋白表现均有下降趋势，量化统计后可以更清楚看到p-NF-κB蛋白表达显著减少。我们认为TET能下调EGFR与NF-κB的表达而抑制GBM8401细胞的移行与侵袭。
NF-κB的活化与癌细胞的迁移和侵入有关[8]。NF-κB蛋白表达升高将促进癌细胞增生、存活与转移，进一步导致GBM8401细胞的恶性程度上升[9]。我们的结果显示TET能减少EGFR与NF-κB的表达而抑制GBM8401细胞转移。这些结果与其他研究指出的抑制EGFR相关下游信号传递能够减少癌细胞转移的结果一致[10]。MMP-2、MMP-9在许多高度转移的癌细胞中被表现大量表达，MMP-2、MMP-9是破坏ECM不可缺少的蛋白[11]。TET抑制MMP-2的活性与蛋白质的表现，有效地减少细胞移行与侵袭的能力[12]，TET对GBM8401细胞MMP-2等基质金属蛋白酶的调控作用还需要深入研究。TET对肿瘤的抑制作用不仅能通过EGFR实现，还可以通过PI3K-Akt、p-JNK1/2、Jun等信号实现对恶性肿瘤细胞的调控[12]，本研究在GBM8401细胞研究中，提供了有关TET抑制GBM8401细胞转移的证据，认为TET对GBM8401细胞转移是一个相当有潜力的天然抑制剂。
参考文献
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