【摘要】 目的：探讨四羟基壬烯(4-hydroxynonenal，4-HNE)的表达及其在前列腺癌发生发展中的的作用。方法：将GSTcDNA转染人前列腺癌细胞以建立细胞内低4-HNE低水平细胞模型，检测其雄激素受体以及MAKP、AKT、PKC等相关调控基因的表达；以不同剂量4-HNE诱导前列腺癌细胞，检测其雄激素受体及相关调控基因的表达，研究细胞内外不同4-HNE水平的情况下前列腺癌细胞对双氢睾酮的敏感性变化。结果：DHT-LNCaP 组AR蛋白更多定位于细胞核，Bicalutamide-LNCaP组细胞，AR核定位减少，同时人PSA ELISA结果表明DHT刺激后，LNCaP细胞中的PSA分泌量增高，Bicalutamide刺激后，LNCaP细胞中的PSA分泌量降低。DHT可以增强AR的活性， Bicalutamide能够抑制AR的活性。AR活性的改变，c-Myc蛋白和PSA 蛋白有着正性的调控作用，而对4-HNE表达量的调控是一种正性作用。当AR的活性增高时，4-HNE的表达量增高，而当AR的活性降低时，4-HNE的表达量降低。结论：4-HNE 是前列腺癌的重要促进分子，并且是AR通路中的起关键调控作用。
四羟基壬烯（4-hydroxynonenal，4-HNE）为脂质过氧化反应醛基产物，对细胞分化、增殖及凋亡起调控作用[1]。本研究通过构建4-HNE的慢病毒载体，感染前列腺癌LNCaP细胞中稳定过表达 4-HNE蛋白，经过药物筛选，构建LNCa P的4-HNE 稳转细胞系，并检测了4-HNE对LNCaP细胞增殖能力的影响，并通过 Western blot的方法检测相关蛋白的表达，以求寻找其发挥作用的分子机制。
1.材料：
细胞株、慢病毒包装载体：前列腺癌LNCaP细胞均够买自中科院上海细胞库。LNCaP细胞是在前列腺癌患者锁骨上淋巴结转移灶中提取的细胞并建系的，其表达AR受体，并表现出雄激素依赖性生长，LNCaP细胞可以在经过传代之后，可以发生不依赖雄激素的生长，作为早期 CRPC 的细胞模型。常规传代冻存，以含10%新生牛血清、RPMI 1640 培养基，在37℃、饱和湿度及 5%CO2条件下培养。慢病毒包装采用第二代3质粒系统：包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G （购自美国Addgene公司）和载体质粒pLenti6.3/V5-DEST（美国 Invitrogen 公司）。3种质粒均由实验室扩增并保存，包含有 4-HNE、Cherry红色荧光蛋白及lacZ基因序列p Lenti6.3/V5-DEST-4-HNE。用来进行质粒转化和扩增的感受态细胞XL10由生化实验室制备保存。
2.方法
2.1 慢病毒包装 ：步骤包括： 质粒转化扩增，质粒提取 ，慢病毒包装 ，稳定转染 4-HNE 前列腺癌细胞株的构建及鉴定，杀稻瘟菌素（Blasticidin）最优浓度的筛选
2.2慢病毒感染细胞核稳定细胞株的筛选及鉴定
2.3 4-HNE在CRPC细胞（LNCaP）中的作用及机制研究
2.3.1 细胞生长曲线（噻唑蓝比色法）收获对数生长期的LNCaP以及其相应的稳定转染4-HNE细胞以5×103接种于96孔板中。为考察 4-HNE对LNCaP细胞的作用：实验细胞共分为 3组：两种细胞分别3组：空白对照组（未处理组）、阴性对照组（Lenti-Lac Z组）、实验组（Lenti-4-HNE组）。为检测AR信号通路的活化，LNCaP细胞贴壁后，加药刺激，根据加药不同，分为3组：空白对照组（PBS处理组）、阴性对照组（加 0.01%的乙醇或0.01% DMSO）、实验组（加入10nMDHT或 10μM匹卡鲁胺），每组设6个复孔。在1d，2d，3d，4d，5d，6d 时，向每孔加入20μL新鲜配制的噻唑蓝（MTT，Wolsen公司）溶液（5mg/m L），37℃继续培养4h，150μL二甲基亚砜（DMSO，Gibco公司），振荡10min，使结晶物充分溶解，选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值（OD值），取6个复孔的OD值的平均数。以OD值为纵坐标，感染时间为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
2.3.2 EdU染色
荧光显微镜下（400×）随机选取10个视野，观察EdU染色阳性（红色荧光）细胞所占细胞总数比例，进行统计学分析。
2.3.3 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡
将LNCaP以及其相应的稳定转染4-HNE细胞以5×105接种于 6 孔板中。各个药物刺激组用相应药物刺激 5 天后（药物剂量同前，对照同前），收获细胞转移至离心管，PBS 洗涤，75%乙醇固定。然后用50μL结合缓冲液重悬细胞，每组处理细胞分别加入碘化丙啶（PI）和凋亡检测试剂AnnexinV-FITC（Bipec公司），室温避光温育15min，上机检测。细胞周期凋亡分析采用美国 Becton Diekinson 公司的 Cell Quit Plot 分析软件分析细胞周期和凋亡的变化，重复实验 4 次。
2.3.4 免疫蛋白印迹（Western blot，WB）
2.3.5 免疫荧光检测药物刺激后AR核定位情况：将LNCaP以及其相应的稳定转染4-HNE细胞以1×105接种于24孔板中，相应药物刺激（DHT，匹卡鲁胺）刺激 5 天。 一抗孵育，4℃过夜，一般要大于18h或者37℃1-2h。PBS 洗净，3min，5 次。 荧光二抗孵育，37℃，1h，荧光显微镜下观察AR核定位情况，并拍照。
2.3.6 人PSA-ELISA检测将LNCaP以及其相应的稳定转染4-HNE细胞以5×105接种于6孔板中。各个药物刺激组用相应药物刺激 5 天后（药物剂量同前，对照同前），收集培养液上清，上清经过 3000rpm，离心10min后，去除颗粒和聚合物，-20℃保存备用，而后进行ELISA检测。 在450nm波长处测定各孔的光吸收值。 绘制标准曲线：在 Excel 工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应光吸收值作为纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值，而后汇总数据，进行统计学分析。
2.4 统计学方法
采用 SPSS18.0 进行统计学分析。结果中定量数据用x±s表示，多组均数比较进行方差齐性检验后用单因素方差分析（one-way ANVOA），组间差异使用 SNK-q检验，样本间率的比较采用χ2检验，检验水准为α= 0.05，P＜0.05为差异有显著性。
3.结果
3.1 慢病毒感染效率以及4-HNE稳转细胞系的鉴定
收获得慢病毒分别命名为Lenti-Cherry、Lenti-Lac Z 和 Lenti-4-HNE。利用慢病毒病毒感染 LNCaP细胞48h后倒置荧光显微镜观察，结果发现慢病毒的感染效率可达80％药物筛选结果。而后换用含最优浓度 Blasticidin的培养基（LNCaP为4μg/mL）筛选3周后，倒置荧光显微镜观察，结果发现慢病毒的感染效率可达100％。而后Western blot检测表明，Lenti-4-HNE感染筛选后建立的4-HNE稳转LNCaP细胞能够正确表达4-HNE蛋白。
3.2 CRPC细胞AR通路活性变化对4-HNE表达水平的影响
细胞生长曲线显示，同对照组相比，培养第 3 天开始DHT药物刺激组LNCaP细胞的生长增殖能力加强，而受到抑制（F≥5.57，P＜0.05），从培养的第 4 天开始，匹卡鲁胺药物刺激组LNCaP细胞生长受到抑制（F≥4.89，P＜0.05）。EdU染色结果显示，药物刺激 5 天后，同对照组相比，DHT-LNCaP组Ed U阳性染色细胞比例明显升高（LNCaP: F=59.89, P＜0.01），提示 DHT-LNCa P增殖细胞比例升高，增殖受到促进；Bicalutamide-LNCaP组EdU阳性染色细胞比例明显降低（LNCa P: F=61.79, P＜0.01），增殖受到抑制。流式细胞术检测结果，同对照组相比，DHT-LNCaP组G1期细胞减少，更多细胞处于S期（LNCaP: F=19.72, P＜0.01），凋亡检测显示凋亡细胞减少（LNCa P: F=20.37, P＜0.01），提示两组细胞增殖得到促进，细胞凋亡受到抑制。而 Bicalutamide–LNCaP组更多细胞阻滞于G1期，S期细胞减少（LNCa P: F=20.21, P＜0.01）。同时凋亡检测，细胞细胞凋亡增加（LNCaP: F=251.79, P＜0.01）。提示细胞生长受到抑制。同时Western-blot检测显示，DHT刺激后，LNCaP细胞中的AR表达量增高。 Bicalutamide刺激后，LNCaP细胞中的AR表达量降低。通过免疫荧光检测，DHT-LNCaP 组AR蛋白更多定位于细胞核，Bicalutamide-LNCaP组细胞，AR核定位减少，同时人PSA ELISA结果表明DHT刺激后，LNCaP细胞中的PSA分泌量增高，Bicalutamide刺激后，LNCaP细胞中的PSA分泌量降低。以上的结果表明DHT可以增强AR的活性，而 Bicalutamide能够抑制AR的活性。AR活性的改变，c-Myc蛋白和PSA 蛋白有着正性的调控作用，而对4-HNE表达量的调控是一种正性作用。当AR的活性增高时，4-HNE的表达量增高，而当AR的活性降低时，4-HNE的表达量降低。
4.讨论：
对于激素难治型前列腺癌发生机制目前尚不明了，因此目前尚无有效治疗方法。对于其发生机制，目前有许多假说，但均无法对其作出全面解释，近年来，雄激素受体表达的旁路调节机制渐受重视。研究表明，细胞促有丝分裂蛋白激酶（MAPK） 和（AKT）作为重要的细胞信号传导分子可使前列腺癌细胞雄激素受体磷酸化后对双氢睾酮敏感性明显增强，并可促使其信号传导入细胞核从而促进细胞生长。MAPK在激素难治型前列腺癌中表达明显增加，并与前列腺癌分期、分级呈正相关[2]。激素敏感型前列腺癌细胞转染Ras基因可致MAPK激活及高表达从而导致激素逃逸的发生[3]。在激素不敏感型前列腺癌细胞中AKT活性亦明显增加，并可通过雄激素受体磷酸化而促其信号传导入核[4]。四羟基壬烯（4-hydroxynonenal，4-HNE）作为人体内重要的氧化应激终产物对细胞分化、增殖及凋亡起调控作用[5]。进一步研究表明4-HNE可促使MAPK及AKT高表达，4-HNE可能为前列腺癌细胞增殖及激素逃逸发生的重要调控物质［1］。
本研究中Western-blot检测显示，DHT刺激后，LNCaP细胞中的AR表达量增高。 Bicalutamide刺激后，LNCaP细胞中的AR表达量降低。PSA ELISA检测结果表明DHT刺激后，LNCaP细胞中的PSA分泌量增高，Bicalutamide刺激后，LNCaP细胞中的PSA分泌量降低，表明DHT可以增强AR的活性，而 Bicalutamide能够抑制AR的活性。AR活性的改变，c-Myc蛋白和PSA 蛋白有着正性的调控作用，而对4-HNE表达量的调控是一种正性作用。当AR的活性增高时，4-HNE的表达量增高，而当AR的活性降低时，4-HNE的表达量降低。4-HNE表达水平升高，通过雄激素受体表达的旁路调节机制（MAPK、AKT介导），可能造成了前列腺癌细胞增殖及激素逃逸的发生，使患者易发展为去势抵抗性前列腺癌，4-HNE在CRPC的发生发展过程中，起到促进作用。推断4-HNE 是AR得下游基因，受到AR的调控，同时发现4-HNE的过表达可以上调PSA的表达及分泌。而当我们通过AR的激动剂和抑制剂来刺激LNCaP时，AR的表达水平和核定稳定比例都出现现了明显的变化，这种变化不但可以对c-Myc和PSA产生正向的调控作用，对4-HNE也有着正调控作用。c-Myc被认为是4-HNE的上游调节基因，而PSA是AR调控的下游基因，并被认为是前列腺癌诊断和判断预后的重要指标我们推断4-HNE是AR-PSA这条通路上的重要的中间环节，其受到AR的调控，并且4-HNE的能够上调PSA的表达，可以认为是在一定程度上促进了CRPC细胞的恶性表型。此外，我们的研究还发现，4-HNE很可能参与了细胞周期的调控，其能够促进LNCaP细胞从G1期进入S期，这种作用是通过调控G1期相关分子实现的（激活分子cyclin D1、cyclin E、CDK2、CDK4。抑制分子：p27）[6]。有研究证实，4-HNE和前列腺癌分级高度相关[7]。
综上所述，所有的结果表明，4-HNE 是前列腺癌的重要促进分子，并且是AR通路中的起关键调控作用。因此我们认为 4-HNE 很可能成为前列腺癌的新的治疗靶点。
参考文献：
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5. Awasthi YC, Yang Y, Tiwari NK, Patrick B, Sharma A, Li J, Awasthi S. Regulation of 4-hydroxynonenal-mediated signaling by glutathione S-transferases. Free Radic Biol Med. 2004, 37: 607-619
6.Pfeuty B. Strategic Cell-Cycle Regulatory Features That Provide Mammalian Cells with Tunable G1 Length and Reversible G1 Arrest. PLo S One 2012; 7(4):e35291.
7.宋旭，王蓉，肖锋，等.四羟基壬烯的表达及其在前列腺癌雄激素拮抗中的作用[J].国际泌尿系统杂志，2017，37（5）：641-643
作者信息：宋旭，博士在读，主任医师，主要研究方向：泌尿系统肿瘤和微创手术，工作单位及邮编：上海中医药大学附属第七人民医院泌尿外科200137，通讯地址及邮编：上海浦东大同路358号上海中医药大学附属第七人民医院泌尿外科200137
基金项目：上海市浦东新区卫生和计划生育委员会重点专科基金资助项目（PWZxk 2017-19）
1上海中医药大学附属第七人民医院泌尿外科(上海，200137)
通信作者：宋旭，。