王伟宏
（黑龙江省大庆市疾病预防控制中心微生物实验室；黑龙江大庆163311）
【摘要】目的：探讨温度控制对培养流感病毒细胞的影响。方法：选取分离、富集的流感病毒细胞在不同温度下培养，观察贴壁、存活情况，分析温度控制的效果。结果：40℃、37℃、33℃下均能看到流感病毒细胞贴壁、存活，37℃流感病毒细胞贴壁最多，相比40℃、33℃存在显著统计学差异，P＜0.05；33℃流感病毒细胞贴壁率显著高于40℃，P＜0.05。结论：温度控制对体外培养流感病毒细胞有显著影响，37℃最适宜于体外培养，温度越高则培养效果越差，低于37℃时流感病毒细胞贴壁、存活时间有所缩短。
【关键词】温度控制；狗肾细胞；流感病毒细胞；体外培养；存活
当前人们为了有效预防流感以及治疗流感，正在研究一系列的流感病毒体外培养的方法。要保证流感病毒细胞在体外正常繁殖生长，就必须保证培养的各个环节正常进行。体外培养流感病毒在与体内培养病毒的方式存在明显不同[1]。在体外条件下，大多数的流感病毒受到的温度影响较大。因此本文对温度控制对流感病毒细胞的体外培养进行研究，从而获得最佳的温度控制范围，提高流感病毒细胞的培养水平。
1资料与方法
1.1一般资料
选择某医院作为监测观察点，该地区流感爆发疫情的对象做为研究对象。纳入标准：体温≥38摄氏度，咽喉疼痛，有咳嗽症状，采集流感病毒发作3天之内、未服用抗病毒药物的流感样患者的咽拭子。
1.2方法
将采集的咽拭子放置在3毫升的Hank氏液中，保存设置温度为4~8摄氏度，在24小时内送检。
病毒分离与鉴定：准备75%~90%的成片细胞，用40倍镜对细胞的生长状态进行观察，将处于对数生长的MDCK细胞倒出，用1毫升的Hank氏液清洗细胞1~2遍，加入2μ克/毫升的TPCK-胰酶生长液[2]。
细胞培养管接种：送检24h内进行流感病毒分离，利用无菌滤膜吸管吸取200μL的样品放置在细胞的培养管中，分明设置37摄氏度、33摄氏度、40摄氏度的培养温度，对细胞的病变情况进行培养观察，24小时内出现CPE是因为标本中非特异性成分引起毒性反应。取100μL阳性分离物传二代。
收获培养物：当70%~100%的细胞发生病变时进行收获，没有发生病变的细胞，在第7天收获进行盲传。收获前对细胞进行冻融，用1%的人O型血进行鉴定后再采用血凝抑制试验，对血凝阳性的培养液进行严格病毒的鉴定和分型。
1.3统计学分析
软件SPSS19．0分析，计量资料t检验；计数资料方差检验。P<0.05显著差异。
1.4观察指标
贴壁率：可以衡量细胞存活率，数值越高细胞存活数量越多。
2结果
37℃流感病毒细胞贴壁率最高，相比40℃、33℃存在显著统计学差异，X2=10.24，12.03，P＜0.05；33℃流感病毒细胞贴壁率显著高于40℃，X2=9.75，P＜0.05
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3讨论
流感病毒分为人流感病毒以及动物流感病毒两种类型。为了加强对流感病毒的了解以及监测，就必须要得到流感病毒毒株进行流感病毒的体外培养[3]。细胞组织培养只能是从机体中抽出细胞或组织，然后模拟机体内的内环境进行体外培养。流感病毒细胞组织培养，主要是为流感病毒提供一个良好的体外生存环境，使细胞对环境产生适应性，从而进行繁殖和存活。病毒在敏感细胞中繁殖，能够引起细胞代谢等多方面的变化，细胞病变后将病毒释放到维持液中，这种情况可以用细胞色变法等检测病毒抗原从而判断病毒的存在。有的病毒不会引起细胞的病变，在核内繁殖后不容易释放到维持液中，这时候要需要采用免疫荧光的方法来进行检测。一般情况下病毒细胞主要来源于人、猴以及昆虫等，这些都是常见的组织来源，流感病毒培养来源主要是病毒的自然宿主细胞。
注意在进行流感病毒培养过程中，要掌握几个方面：培养中病毒效价和放置时间成为反比，放置时间越长，病毒的效价就会越低，所以一定要做好时间的掌控。细胞培养后在1~2天内集中病毒，时间过长就会导致细胞对病毒的吸附力降低，培养结束后观察细胞情况，用Hank氏溶液清洗细胞后，直接用病毒培养液然后开始接种，这样可以避免发生污染[4]。细胞接种后会分泌出部分代谢物，导致培养液PH变化并且呈现黄色，可以加入少量的碳酸氢钠，从而调节培养液PH，避免细胞死亡。
理论上讲人体内所有的细胞都会受到温度变化的影响，在机体的正常温度范围内，细胞能够正常的繁殖和代谢，一旦温度超过机体可调节的温度范围，就会导致细胞的繁殖异常。从本次研究结果来看，温度升高对流感病毒培养影响很大。40℃培养环境严重影响了细胞繁殖，导致细胞大量死亡，这是因为细胞会因为温度的显著变化而损伤甚至出现死亡。不同类型细胞对于温度的反应是不同的[5]，相对情况下低温对细胞的生长繁殖影响较小，高温环境下细胞的增殖速度较缓慢会引起死亡等，因为高热会导致酶变性失活严重影响细胞代谢的过程，另外细胞膜的类脂质成分使得细胞膜的渗透性发生明显变化时。温度升高还会引起核分裂异常，例如多极分裂，同时能够释放细胞包浆，钙离子被释放后能够激活引起细胞凝固的酶。33℃时细胞培养受到影响相比40℃较小，33℃流感病毒细胞贴壁、存活时间显著高于40℃，P＜0.05。
综上，温度控制对体外培养流感病毒细胞有显著影响，37℃最适宜于体外培养，温度越高则培养效果越差，低于37℃时流感病毒细胞贴壁、存活时间有所缩短。
参考文献：
[1]张玉,周曦,易龙,等.大鼠原代肝星状细胞分离、鉴定及培养方法的研究[J].局解手术学杂志,2018,027(001):5-11.
[2]孙如玉,姜楠,刘超,等.人胰腺癌细胞系PANC-1细胞培养方法的改良[J].医药前沿,2019,009(011):60-61.
[3]李庆飞,崔坤,艾庆辉.培养温度对LPS诱导的离体大黄鱼头肾巨噬细胞抗氧化能力和炎性反应的影响[J].水产学报,2019,043(004):810-819.
[4]卢美琳,阿依木古丽,乔自林,等.动物细胞生物反应器培养常用参数的现状分析[J].甘肃畜牧兽医,2018,48(10):31-33.
[5]周霞,吴万里,胡澜怀.不同培养基分离流感病毒效果及最佳培养条件[J].中国卫生检验杂志,2018,028(008):941-944.