摘 要 为了开发原花青素的提取方法，本文以云南红糙米米糠为原料，在单因素实验基础上通过正交实验研究了原花青素的双水相提取优化工艺。结果表明影响乙醇-硫酸铵双水相提取原花青素的因素次序为：硫酸铵质量分数＞乙醇体积分数＞料液比＞提取温度。最佳提取工艺为硫酸铵质量分数为20%，乙醇体积分数为65%，料液比为1:25 g·mL-1，提取温度为55 °C。所得红糙米米糠中原花青素为8.22 mg·g-1。可见，用此工艺提取原花青素具有较好的应用前景，促进了红糙米米糠原花青素的合理开发利用。
关键词 双水相；原花青素；红糙米米糠；正交实验；提取工艺
米糠是稻谷加工的主要副产物，约占稻谷质量的8%~10%，富含多酚(9.60~81.85 mg GAE·g-1)[1]、蛋白质、膳食纤维、矿物质、维生素等生理活性物质。我国米糠年产量接近2 000万吨，而大部分米糠被用作替代玉米进行禽畜喂养，导致了米糠资源的极大浪费[2，3]。因此，推进米糠有效成分的提取、开发应用有重大的意义，既有利于农产品加工废料的开发利用，又可提高食品安全性。
原花青素(procyanidin)简称PC，是植物界中广泛存在的一类由黄烷-3-醇缩合而成的多酚类化合物，因其在强酸的条件下能产生红色花青素而得名[4，5]。原花青素具有极强的抗氧化活性和消除自由基的作用[6-8]，是国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂。因此具有抗癌，抑制亚硝化[9]，降血糖[10]，改善视力，止泻[11]等功效，在食品、临床医学和化妆品领域备受青睐。早在1995年美国民众无记名投票就将其推选为最受欢迎的十大药物之一[12]。
目前，提取原花青素工艺主要有醇提法、微波（超声波）辅助提取、酶法提取等[13]。双水相萃取法[14]，是一种新型的液-液萃取技术，利用亲水性有机溶剂和盐混合后由于盐析作用形成两相；当粉末加入有机溶剂/盐双水相体系后，少量多酚类物质进入下相（富盐相），而大部分多酚类物质进入上相（有机溶剂相）。该提取法具有操作简单、传质速度快、收率高且几乎没有有机溶剂残留等优点[15，16]。目前尚未见双水相法在提取红糙米米糠原花青素方面的应用，本研究以高原红糙米米糠为原材料，以一定浓度的乙醇溶液和硫酸铵组成的双水相体系提取原花青素，并通过单因素实验和正交实验，考察各因素对提取量的影响，确定双水相体系提取红糙米米糠中原花青素的最佳工艺条件。
1 材料与方法
1.1材料与仪器
红糙米米糠，购于云南省昔马镇；儿茶素标准品（≥95%），北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇，香草醛，硫酸铵，甲醇，均为分析纯。
DFT-250A手提式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；KQ-C玻璃仪器气流烘干箱（巩义市予华仪器有限责任公司）；EPED-10TH实验室超纯水器（南京易普易达科技发展有限公司）；UV5100紫外/可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 提取工艺 红糙米米糠→恒温干燥→粉碎过60目筛→乙醇-硫酸铵双水相体系提取→搅拌→上相液离心→显色→测吸光度。
1.2.2 含量测定 采用香草醛-浓盐酸法[17]测含量。将儿茶素标准品溶于一定量的蒸馏水中分别配制浓度为0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1 的一系列标准液，吸取1.0 mL标准液于10 mL比色管中，加入6.0 mL香草醛甲醇溶液，再加入3.0 mL的浓盐酸，在避光的环境下反应15 min于500 nm处测定吸光值（以超纯水作对照）。以儿茶素浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制原花青素标准曲线，线性回归方程为y=2.0003x+0.0355，R2=0.9988。
1.2.3 PC提取量的计算
PC提取量(mg·g-1)= （1）
式中，c为测定的原花青素的浓度（mg·mL-1）；V为提取液上相的总体积（mL）；N为稀释倍数；m为每次称取米糠粉末的质量(g）。
1.2.4 不同因素对红糙米米糠PC提取量的影响
（1）硫酸铵质量分数对红糙米米糠PC提取量的影响 以料液比1:25 g·mL-1，加入乙醇体积分数为55%和硫酸铵质量分数为16%、18%、20%、22%、24%的双水相溶液，置于45 °C恒温水浴锅中搅拌提取45 min，计算原花青素提取量。
（2）乙醇体积分数对红糙米米糠PC提取量的影响 按照料液比1:25 g·mL-1，加入硫酸铵质量分数为18%和乙醇体积分数45%、50%、55%、60%、65%的双水相溶液，置于45 °C恒温水浴锅中搅拌提取45 min，计算原花青素提取量。
（3）料液比对红糙米米糠PC提取量的影响 按照料液比1:15 g·mL-1、1:20 g·mL-1、1:25 g·mL-1、1:30 g·mL-1、1:35 g·mL-1，加入硫酸铵质量分数为18%和乙醇体积分数55%的双水相溶液，置于45 °C恒温水浴锅中搅拌提取45 min，计算原花青素提取量。
（4）提取温度对红糙米米糠PC提取量的影响 按照料液比1:25 g·mL-1，加入硫酸铵质量分数为18%和乙醇体积分数55%的双水相溶液，置于35 °C、45 °C、55 °C、65 °C、75 °C恒温水浴锅中搅拌提取45 min，计算原花青素提取量。
（5）提取时间对红糙米米糠PC提取量的影响 按照料液比1:25 g·mL-1，加入硫酸铵质量分数为18%和乙醇体积分数55%的双水相溶液，置于45 °C恒温水浴锅中搅拌提取45 min、60 min、75 min、90 min、105 min，计算原花青素提取量。
1.2.5 正交优化实验
根据单因素结果，选取对PC提取量影响显著的4个单因素作为正交实验的考察因素，以红糙米米糠中PC的提取量为指标，采用四因素三水平L9(34)的正交实验优化红糙米米糠中PC的提取。
2结果与分析
2.1单因素实验结果及分析
2.1.1硫酸铵质量分数对红糙米米糠PC提取量的影响
由图1可知，随硫酸铵质量分数的逐渐增加，红糙米米糠中PC提取量总的趋势是先增大后减小，在16%~18%范围内，原花青素PC提取量不断增大，可能是随着硫酸铵质量分数的增加，它与水分子的氢键作用增强，争夺水分子的能力也增大，使上相中水量减少，乙醇体积分数相对增大，上相极性也增大，使PC逐渐溶出；根据相似相容原理，当硫酸铵质量分数为18%时，上相提取液的极性与PC最相近，最大提取量为6.75 mg·g-1；PC提取量在18%~20%范围内急剧下降，20%以后缓慢下降逐渐并趋于平缓。分析原因，当硫酸铵质量分数超18%时，超过了该体系的萃取能力，上相达到饱和，PC便转移到下相。因此，18%为最佳硫酸铵质量分数。
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图1 硫酸铵质量分数对红糙米米糠PC提取量的影响
Fig.1 Effect of mass fraction of ammonium sulfate on PC extraction of red brown rice bran
2.1.2乙醇体积分数对红糙米米糠PC提取量的影响
由图2可知，随着乙醇体积分数的增大，PC提取量总体呈先增后减趋势，当体系中乙醇体积分数由55% 增加到60%时，PC提取量显著升高( p＜0.01) ，因为乙醇浓度增加，能得双水相体系形成的稳定性增加，同时，上相极性增大，萃取能力增强，导致提取量上升；当乙醇体积分数为60% 时，PC提取量最高，达到7.14 mg·g-1，随后呈现下降趋势，可能是犹豫乙醇体积分数的过分增加，下相硫酸铵析出，同时其他成分如单宁、白藜芦醇等也会溶解，影响PC的纯度和稳定性。综合来看，60%为最佳提取条件的乙醇体积分数。
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图2乙醇体积分数对红糙米米糠PC提取量的影响
Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on PC extraction of red brown rice bran
2.1.3料液比对红糙米米糠PC提取量的影响
由图3可知，当料液比由1:15 g·mL-1增至1:20 g·mL-1，PC提取量显著升高，当料液比为1:20 g·mL-1 时，PC提取量最高（7.62 mg·g-1），可能是在较高料液比下，有利于溶剂渗透和扩散到红糙米米糠细胞内，增大两相间的浓度差，增大推动力，使PC快速向溶剂中扩散，提高了PC提取量[16]，当料液比由1:20 g·mL-1增加到1:35 g·mL-1，PC提取量减少。因此，最佳料液比为1:20 g·mL-1。
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图3料液比对红糙米米糠PC提取量的影响
Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on PC extraction of red brown rice bran
2.1.4提取温度对红糙米米糠PC提取量的影响
由图4可知，在提取温度小于55 °C，PC提取量随温度的增大而增加显著，当温度为55 °C时PC提取量达最大值，等于7.98 mg·g-1，当温度大于55 °C时，PC提取量降低。分析可能是因为低温区时，温度升高能加快乙醇的扩散，加速PC溶出，使其含量增加。而过高的温度，会使部分PC的聚合结构遭到破坏。综合来看，55 °C为最佳提取温度。
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图4提取温度对红糙米米糠PC提取量的影响
Fig.4 Effect of extraction temperature on PC extraction of red brown rice bran
2.1.5提取时间对红糙米米糠PC提取量的影响
由图5 可以看出，在45-90 min 之间，PC提取量随着提取时间的延长而增大，当提取时间超过90 min 后，继续增加提取时间PC提取量减小。细胞内部溶质的溶解和扩散需要一定的时间，提取时间太短PC不能及时溶出，而提取时间过长又会使PC稳定性降低。因此，PC的最佳提取时间为90 min。
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图5提取时间对红糙米米糠PC提取量的影响
Fig.5 Effect of extraction time on PC extraction of red brown rice bran
2.2正交实验结果分析
结合单因素实验结果，固定提取时间为90 min，选择硫酸铵质量分数(A)、乙醇体积分数(B)、料液比(C)、提取温度(D)作为正交实验的考察因素，以红糙米米糠PC提取量为指标，按照表1的实验安排对提取工艺条件进行优化。每组实验条件下做了3次平行实验，3次实验的平均提取量和极差分析列于表2，方差分析结果见表3。
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由表2可知，R(A)＞R (B)＞R (C)＞R (D) ，说明4个因素对红糙米米糠PC提取量的影响顺序为：硫酸铵质量分数＞乙醇体积分数＞料液比＞提取温度，硫酸质量分数对红糙米米糠PC提取量影响最大，提取温度影响最小。比较k值可知，最佳提取工艺为A3B3C3D2，即硫酸铵质量分数为20%，乙醇体积分数为65%，料液比为1:25 g·mL-1，提取温度为55 °C。由于此工艺条件并未出现在正交实验安排的实验中，对最优工艺参数条件下的提取效果进行三次验证实验，计算得红糙米米糠PC提取量分别为8.24 mg·g-1、8.33 mg·g-1和8.10 mg·g-1，平均值为8.22 mg·g-1，比表中得率最高的组合A3B1C3D2的值8.18 mg·g-1大，优于直观分析的最佳组合，结果可靠。经方差分析，从表3可知，4个因素的显著水平p值均为0.000（＜0.01），再次验证所选的4个因素对双水相提取结果有极显著影响。
3讨论与结论
2017年杨豆[3]等用乙醇浸提米糠中的PC，在最优工艺条件：乙醇体积分数60%，搅拌速度150 r·min-1，提取温度55 °C，料液比1:18 g·mL-1，提取时间40 min下，得率达3.772%。相比之下，用双水相法提取能有效提高红糙米米糠PC的提取量：
（1）从单因素实验可知单个较佳工艺条件是：硫酸铵质量分数18%，乙醇体积分数60%，料液比1:20 g·mL-1，提取温度55 °C，提取时间90 min。
（2）用正交实验法对工艺进行优化，得到4因素对红糙米米糠PC提取量的影响顺序是：硫酸铵质量分数＞ 乙醇体积分数＞料液比＞ 提取温度，硫酸铵质量分数对提取量影响最大，并确定最佳优化条件为：硫酸铵质量分数为20%，乙醇体积分数为65%，料液比为1:25 g·mL-1，提取温度为55 °C。在此工艺参数下，固定提取时间为90 min，红糙米米糠PC提取量可达8.22 mg·g-1。
（3）因此，采用本工艺从糙米糠中提取PC，具有较好的应用前景。
参 考 文 献
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