摘要：头孢氨苄作为第一代口服的头孢菌素类抗生素，对多种革兰阳性菌和革兰阴性菌均有很强的抗菌活性。目前我国制药工业中生产头孢氨苄主要是化学合成法，合成过程步骤繁琐，对环境污染严重。与传统化学合成法相比，生物酶法合成头孢氨苄具有反应条件温和、工艺简便、绿色环保、洁净安全等优点。对酶法合成头孢羟氨苄的工艺条件进行优化，以7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸7-ADCA为母核，对羟基苯甘氨酸甲酯 D-HPGM为酰基供体，利用青霉素G酰化酶(PGA)在水相体系中酶促合成头孢羟氨苄。该实验以温度、pH值、侧链与母核的摩尔比、投酶量因素对头孢羟氨苄合成工艺条件进行优化，转化反应过程中按时取样，利用高效液相色谱仪对母核进行定量分析，追踪母核7-ADCA转化率，直至终止反应。实验结果表明，在温度为20℃、pH6.5、摩尔比1.2:1、投酶量20g、母核浓度13%、采用新A4酶的工艺条件下，母核的转化率可达到99.47%。
关键词：青霉素G酰化酶；头孢氨苄；7-ADCA
近年来国内外都在致力于酶法合成的研究，酶法合成头孢氨苄有着许多化学法无可比拟的优点，它具有反应条件温和、工艺操作简单、无需基团保护、清洁安全等优点，酶法制备头孢菌素在工业上有很大的潜力，生物酶的合成方法和路线具有一定的经济效益。本实验以头孢羟氨苄为模型化合物，采用固定化青霉素G酰化酶催化母核7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)与侧链对羟基苯甘氨酸甲酯(D-HPGM)转化制备头孢羟氨苄，考察了影响酶法合成头孢羟氨苄工艺的因素并优化了工艺条件。
一、材料与方法
1、材料。固定化青霉素G酰化酶新A4(活力单位为250U/g)、固定化青霉素G酰化酶老B4(活力单位为185U/g)、固定化青霉素G酰化酶PGA(高)(活力单位为135U/g)、母核7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸7-ADCA、侧链对羟基苯甘氨酸甲酯D-HPGM及头孢羟氨苄标准品均由长沙凯晓生物科技有限公司提供。
2、反应原理。本实验采用固定化青霉素G酰化酶催化母核7-ADCA和侧链对羟基苯甘氨酸甲酯在水相体系中转化合成头孢羟氨苄，反应过程中用恒温水浴锅维持反应体系温度不变，用3mol/L氨水和6mol/L盐酸维持反应体系pH稳定。
3、方法
（1）头孢羟氨苄的合成方法。7-ADCA溶液制备：称取7-ADCA 20g于反应烧杯中，加去离子水200mL，用3N氨水调pH7.5±0.05至溶解。对羟基苯甘氨酸甲酯(D-HPGM)溶液制备：称取D-HPGM 20.3g，加去离子水40mL，用6mol/L盐酸调至溶解。酶促合成反应：控制反应温度20℃，开启搅拌，反应烧杯中先一次性加入D-HPGM总量40%的溶液，再加入20g固定化酶开始反应，用6mol/L盐酸和3mol/L氨水控制pH6.9-7.0，再匀速补加D-HPGM溶液剩余部分，2h补完。反应开始后每隔1h取样，离心测上清液中7-ADCA的残留，计算转化率，反应4h，停止反应。
（2）头孢羟氨苄的测定方法。流动相配置：精确称量6.8g磷酸二氢钾，用1000mL超纯水溶解，用氢氧化钾调pH值为5.5，取调好pH溶液960mL，经0.45μm滤膜过滤后加入40mL乙腈，摇匀后超声脱气20min。HPLC 检测条件：色谱柱：C18(250mm×4.6mm, 5μm)；流速为0.7mL/min；检测波长为230nm；进样量为20μL。转化率计算：
二、结果与分析
1、温度对转化率的影响。温度对青霉素G酰化酶的活性有极大的影响，温度过低，则酶的活性很低，而温度过高可能会导致酶的活性失活，而且温度还会影响到头孢羟氨苄和侧链对羟基苯甘氨酸甲酯的水解，因此在酶法合成头孢羟氨苄反应中控制好温度至关重要。所以在控制pH6.5、侧链与母核摩尔比为1.2:1、固定化青霉素G酰化酶新A4的用量为20g等条件不变的情况下，通过设置不同的温度10℃、15℃、20℃、25℃、30℃来研究温度因素对转化率的影响。重复实验3批，取平均转化率进行比较，确定最适转化温度。
通过温度的改变，考察到它对反应体系转化率的影响，观察到当温度在10℃-20℃时，转化率随着温度的升高而升高，在20℃时，转化率达到了最大值为94.79%，之后温度再继续上升，转化率反而开始降低，因此低温是有利于转化反应中转化率的提高，但是过低的温度使反应进行缓慢，转化率降低，而温度过高时，侧链的降解速率也会加快，从而影响了酶的活力和产品收率。综上，确定转化反应体系的最适温度为20℃。
2、pH对转化率的影响。pH的变化对酶的活性也有较大的影响，pH过酸或过碱都会导致酶的分子构象发生改变，从而导致酶的活性失活，只有在最适pH的条件下，酶才会表现出最高的催化活力。因此在温度20℃、侧链与母核摩尔比为1.2:1、青霉素G酰化酶新A4的用量为20g等条件不变的情况下，通过设置不同的pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5来考察pH对转化率的影响。重复实验3批，取平均转化率进行比较，确定最适转化pH。pH的变化对反应体系转化率的影响，pH在5.5-6.5时，反应体系转化率随着pH的升高而升高，在pH6.5时转化率达到最高，为98.36%，当pH大 于6.5时，转化率明显下降，因此转化反应体系的最适pH为pH6.5。
3、侧链与母核摩尔比对转化率的影响。由于侧链相对于母核来说比较廉价，所以一般在工业生产中会多投入一些侧链以促进母核向着转化反应的正反应方向进行，从而提高了转化反应体系的转化率。因此，在温度为20℃、pH6.5、青霉素G酰化酶新A4的用量为20g等条件不变的情况下，通过设定不同的侧链与母核摩尔比1:1、1.8:1来考察侧链与母核的摩尔比对转化反应体系的转化率的影响。重复实验3批，取平均转化率进行比较，确定最适侧链与母核摩尔比。侧链与母核的摩尔比对转化反应体系转化率的影响，可以看出在侧链与母核摩尔比在1.0-1.2之间时，转化率提高很快，说明侧链一定要过量，母核才能与侧链更充分地结合，从而促进转化反应向着转化率更高的方向进行，但是随着侧链投料量的继续增加，过多的侧链降解物会抑制酶活力，导致转化率不再明显提高，而且投料量的增加，意味着更多的经济成本和副产物，更大的分离难度与更高的生产成本。综合考虑，最适侧链与母核摩尔比宜为1.2:1。
4、酶的用量对转化率的影响。酶的用量对转化反应的反应进程的快慢有着至关重要的影响，投入的酶量多，酶的总活力就大，转化反应时间就会缩短，反之，投入的酶量少，酶的总活力小，反应到达结束所用的时间就长，而且还对转化率有着一定的影响。因此，在温度20℃、pH6.5、侧链与母核摩尔比为1.2:1等条件不变的情况下，通过设定青霉素G酰化酶新A4不同的投酶量10、20、30、40和50g来考察酶的用量对转化率的影响。重复实验3批，取平均转化率进行比较，确定最适投酶量。投酶量对转化反应体系转化率的影响，当酶量在10-20g范围内，转化反应体系转化率随着投酶量的增加而提高，但投酶量超过这个范围时，转化率基本不再提高，一般而言酶作为催化剂主要影响转化反应的初始速度，缩短反应时间，而对转化率并没有显著影响，而投酶量过多反而会导致反应方向的偏移和副产物的累积，本实验中过量的酶会催化侧链水解生成大量的副产物，从而抑制了转化反应向正反应方向的进行，并且增加了工业生产的成本，而在本实验中，当投酶量为10g时，转化率较低，这主要是因为转化时产物与副产物的积累抑制了酶的活性。综上所述，对于本反应体系而言，最适的投酶量为20g。
结论
本实验采用固定化青霉素G酰化酶催化母核7-ADCA和侧链对羟基苯甘氨酸甲酯在水相体系中转化合成头孢羟氨苄，反应过程中用恒温水浴锅维持反应体系温度不变，用3mol/L氨水和6mol/L盐酸维持反应体系pH稳定，转化反应过程中按时取样，利用高效液相色谱仪对母核进行定量分析，追踪母核7-ADCA转化率。实验结果表明，在温度为20℃、pH6.5、摩尔比1.2:1、投酶量20g、母核浓度13%、采用新A4酶的工艺条件下，母核的转化率高达99.47%。
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