1黑龙江东北虎林园 黑龙江哈尔滨 150028；2黑龙江省农业科学院畜牧研究所 黑龙江哈尔滨 150086
摘要：虎作为大型肉食动物，位于食物链的顶端，各种病毒包括犬瘟热病毒，猫细小病毒，犬副流感病毒，猫杯状病毒，犬腺病毒，甚至禽流感病毒都已经在虎体内发现，这些病毒不仅威胁着虎的生存，而且有些还威胁着人类的健康，尤其现代社会，人类与虎的接触机会越来越多，对虎病毒性疾病的研究变得很有必要，而目前还未有虎源消化道病毒群落系统研究的报道。
关键词：东北虎、消化道、病毒、宏基因组学
1宏基因组学概述
宏基因组(Metagenome)的概念是1998年由Handelman提出的(Handelsmaneta1．，1998)，指以环境中总的微生物群体基因组为研究对象，通过功能基因筛选和序列分析的方法，来研究微生物的多样性、进化关系、功能活性、种群结构、相互协作关系、以及其与环境之间的关系，这是一种新的研究微生物的方法，并且首次提出了Metagenomics这个单词。具体操作步骤可大概分为，收集特定环境的样品，并对其进行富集，提取富集样品的基因组核酸，然后构建基因组核酸文库(Kohleta1．，2015)；对特定目的基因的筛选；目的基因活性产物表达(黄循柳等，2009；Lieta1．，2015)。通过这种研究方法，克服了以往的研究微生物必须首先进行培养才能进行后续研究的缺点，因为目前人类能够培养的微生物不到微生物总量的1％(Kellenbergereta1．．2001)，这种研究方法可以充分了解未培养的微生物的特性，并且能够从整体水平上了解微生物，对这些未培养微生物的了解能够使人们认识到微生物在特殊条件下生长的生命奥妙，比如生命如何耐过各种极端环境，如何在极端条件下摄取营养，生命进化，及微生物与环境间的相互作用等(贺纪正等，2008)。同时这种研究方法还避免了在实验过程中由于环境以及培养条件的改变而引起的微生物序列变化带来的影响(Tringeeta1．，2005)，可以使人类更全面更充分的了解自然界的生命，研究生命的本质。
2东北虎源消化道病毒宏基因组学分析
病毒宏基因组学作为一种全新的病毒研究方法，以其独特的优势突破了传统方法的瓶颈，直接以整体环境中病毒的全部核酸为研究对象，快速的对环境中的所有病毒组成进行鉴定，故而成为了一种发现新病毒，对病毒遗传变异进行监控的一种有力手段(何彪等，2012)，近年来，很多新病毒通过这种方法被发现，许多病毒的宿主范围也被更广泛的认识到，增强了人们对各种特殊环境病毒群落组成的认识和了解。依托于二代测序技术的病毒宏基因组学分析技术，成为了大规模探查各种病毒的有力工具。
这项新的技术已经被用于探索环境中病毒群落的组成，比如说海洋，湖泊，动物的粪便以及各种动物内脏组织，这毋庸置疑的为这些环境中的病毒多样性的研究打开了一扇窗户，并且为未来在环境中快速发现新病毒提供了范例(Tringeeta1．，2005；Breitbarteta1．，2003)，病毒宏基因组学在病毒发现，病毒溯源，潜在病原预警方面的意义越来越重要。
东北虎作为重要的野生保护动物，其消化道病毒的群落组成对于东北虎的保护和对东北虎病毒性疾病的预防有着很重要的意义。
本研究中，目的是对东北虎消化道病毒进行分析，而东北虎作为珍惜野生保护动物，不能采用常规的剖杀动物对东北虎消化道进行研究，故而此处选用东北虎粪便进行病毒宏基因组学分析，而消化道病毒的范围比较广泛，包含从口到肛门之间的所有部分，此处虽然粪便病毒与消化道病毒不能完全等同，但鉴于条件限制，仍采集了东北虎粪便作为样品对东北虎消化道病毒进行了研究。
首先，随机采集虎粪样品，本研究采集样品时候，是尽可能从不同的虎圈进行采集，同时同一虎圈采集时也是在距离较远的地方采集虎粪样品，尽量避免对同一只东北虎的粪便进行重复采样，但是鉴于虎排粪地点的随机性，也很难避免会有个别重复的虎粪样品的采集，但从不同虎圈采集虎粪就已经从最大程度上避免了虎粪重复，同时由于采集病料时间不同，虽然是尽量选取以前从没有采集过粪便的虎圈进行采集，由于虎圈数量有限，也会有一定程度的重复采样，但是由于是不同的时间，且虎的采食有所差异，测序结果自然也会有一定的差异。
其次是对样品的处理，去除与病毒无关的物质，同时对样品中可能存在的病毒性物质进行富集。本研究中对收集的虎粪样品首先用PBS稀释，将不同份样品进行混合处理，以充分体现高通量测序的优点，也就是对环境中的大量样品进行同时处理，得出结果。将混合样品进行低速离心，以去除与病毒无关的大的颗粒性物质，过滤去除细菌污染，然后进行超速离心，对病毒性小的颗粒物质进行浓缩。
对浓缩后的病毒进行提取核酸，在提取核酸步骤前，首先要对样品进行核酸酶处理，包括DNA酶和RNA酶，这样可以保证病毒衣壳外的核酸片段被酶解掉，而相关研究也证明，在病毒衣壳的保护下，病毒核酸可以对核酸酶保持一定的抵抗力，不会对病毒的核酸起到太大影响，但是在酶处理这一步骤中，酶的量一定要适当，否则可能功亏一篑。酶处理完后很重要的一步就是对已有的核酸酶进行高温失活，这一步要绝对彻底，以防止在下面步骤提取核酸过程中，提出的病毒核酸被残余的酶所分解。病毒核酸提取后应用不依赖序列的单引物扩增的方法对核酸进行PCR扩增，不依赖序列的单引物扩增方法经过多年发展，虽然目前已成为了一套较为成熟的新病毒发现方法，但是由于各个实验室试剂，仪器，以及操作习惯的不同，对各个操作步骤仍需要不断摸索，调整，以达到最佳效果。对病毒核酸扩增后的PCR产物，根据需要进行纯化浓缩，以达到高通量测序的要求。
经过高通量测序得到大量病毒序列，这跟虎的采食密不可分，正常老虎每天用餐达到十几公斤牛肉，同时外加鸡腿或者白条鸡，当前对虎的饲喂食物更是相对比较宽泛，如活鸡，活羊，由于经费有限，有时候也不会饲喂牛肉，活的动物，取而代之的是猪肉，骨头，屠宰场养殖场提供的食物等。本研究中的到的病毒序列像蓝舌病病毒有可能是通过食用带有该病毒的羊肉或者其他食物进入虎的消化道内，像鸡传染性贫血病毒就有可能是通过饲喂带有该病毒的鸡而进入到消化道内的。
参考文献：
1.单同领．病毒宏基因组学分析儿童和猪肠道病毒群落及23株病毒的初步研究[博士学位论文]上海：上海交通大学；2011．
2．韩文，罗玉子，赵碧波，等．基于宏基因组学的猪群样本病毒探测方法的建立．微生物学报，2013，2：016．
3．高婷婷．4株虎源H5N1亚型高致病性禽流感病毒的遗传演化分析【硕士学位论文】山东：山东农业大学；2008．
第一作者简介：宫明，男，1981年9月生，东北农业大学-畜牧兽医，现工作于黑龙江东北虎林园,主要从事东北虎饲养、繁育、预防和治疗，中级兽医师。E-mail: 59304074@qq.com
基金项目：2019-2021年度黑龙江省科技计划省院科技合作项目“虎粪微生物发酵综合利用技术研发与推广”（项目编号：YS19C07)；