摘要：由于桑叶本身含有大量生物活性物质，其具有多种药理特性，如降糖、降脂、抗氧化、抗肿瘤等作用。另外，它还含有纯天然着色剂、抗氧化剂等，已被相关部门纳入药食同源的草药，因此，文章重点对色谱分离纯化桑叶提取物的技术进行了研究，以提高提纯质量和效率。
关键词：色谱；分离；纯化；桑叶；提取物
1.实验部分
1.1试剂与仪器
研究单位为某公司，实验材料为桑叶，分析试剂为无水乙醇和磷酸；色谱纯试剂为乙腈和甲醇；异槲皮苷标准品≥98％。高效液相色谱仪型号为1260；小型高压反应釜型号为CJF-0.05，台式电热恒温鼓风干燥箱型号为DHG-9070A；循环水多功能真空泵型号为SHB-Ⅲ；高速粉碎设备型号为KC-100；傅立叶变换红外光谱仪型号为IRPres-tige-21；超声波清洗设备型号为KQ-250V；半制备色谱仪型号为Geaillenest。
1.2实验方法
1.2.1制备桑叶粗提液
在水热反应釜内胆中放置5g过筛的干桑叶，然后将乙醇和桑叶按照7∶1 mL/g比例，将57％体积分数的乙醇注入反应釜（温度设定为154度）中与水热反应80 min，最后经过滤并分别对滤渣和滤液进行收集。滤液指的是含异槲皮苷的醇提取物；收集的滤渣以供第二次使用。
1.2.2检测分析活性成分
分析设备为分析型高效液相色谱。使用Hypersil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5μm）的色谱柱，流动相为乙腈和0.5％磷酸水溶液，体积比20:80，流速1mL / min，柱温是25°C，进样量10μL。通过分析型液相色谱对样品进行全扫描，并对异槲皮苷的最大吸收波长进行确认，吸收波长为350nm。
1.2.3分离纯化活性成分
色谱柱（C18-8）是半制备液相色谱的条件；使用Hypersil ODS柱（250 mm×10mm，5μm）的色谱柱，流动相是乙腈和0.5％磷酸水溶液，体积比20:80，进样量10 mL，流速20 mL / min，检测波长350 nm，色谱仪为Gelailnest制备型色谱仪，并按照样品保留时间分段收集A，B，C，D四种馏分。然后，根据等式(1)对分离度进行计算。
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其中，tR2是两个相邻峰下一个峰的留存时间；tR1是两个相邻峰之前峰的留存时间；W1和W2是两个相邻峰之间的峰宽。在我国相关规定中，明确规定R≥1.5，被判定为全部分离；如果R <1，则被判定为部分重叠。通常，R=1.5被判定为已经全部分离的标记。
2.结果与讨论
2.1筛选适宜分离纯化的条件
2.1.1选择流动相体系及配比
以20 mL / min的流速和10 mL的进样量，通过对不同比例的甲醇-水和乙腈-水作为流动相对异槲皮苷分离效果影响进行研究，结果发现随着溶剂极性的降低，异槲皮苷的分离度、质量分数、保留时间也会随之降低。如果甲醇的比例小于30％，流动相的洗脱能力不高，无法将异槲皮苷与其他活性成分分离，存在严重拖尾，收集的异槲皮苷不完全，导致产品纯度不高；如果甲醇比例超过50％时，可以在短时间内获得相应组分，但因洗脱能力太高，容易发生异槲皮苷与其他组分无法分离的现象，影响提取纯度。
2.1.2流速对异槲皮苷分离效果的影响
流动相是乙腈和0.5％磷酸水溶液，体积比20:80，进样量为10 mL，通过对异槲皮苷在15、20和25 mL / min流速下的分离效果进行研究，结果显示，在流速增加的情况下，异槲皮苷的留存时间、分离度、样品质量分数都会随之降低。流速越低，峰高会越高，分离度越好，但是流速越低，就会延长洗脱时间。以15 mL / min的速度进行洗脱时，样品留存时间会延长，但是流动相用量和蒸馏时间会较长。以25 mL / min的速度进行洗脱会增加流速，但由于固定相内的扩散阻力会发挥相应的控制作用，在固定相和流动相之间溶质组分的分布偏离平衡幅度上升，会降低分离度，增加色谱峰扩展、溶质稀释程度和流动相，导致经济负担增加，考虑到各种+因素，重点研究了20 mL / min的流速。
2.2检测与分析产品
2.2.1分析制备单体的HPLC定性
把1.2.4节中制备的单体溶液，根据HPLC条件进行分析，并比较标准溶液的峰时间，确定A为绿原酸、B为芦丁、C为异槲皮苷和D为紫云英苷。因此，除异槲皮苷外，还可以通过一次PHPLC分离获取异槲皮苷，同时还可以获取其他三种活性物质（绿原酸、芦丁和紫云英苷）。在此分离过程中，具备耗时少，低毒性，分离效果高且连续制备样品的优点。
2.2.2分析制备单体的红外
通过对所制备的单体红外光谱进行测定，结果表明羰基的波数为1635cm -1，羰基的参考峰约1700cm -1。左移的原因与相邻苯环的双键共轭所致。吸收峰在1510cm-1处时对应的苯环骨架会拉伸振动，吸收峰在1230cm-1处时会出现向高频方向偏移，其原因是由于相邻羟基的诱导或羟基面内振动弯曲引起的。如果出现重叠峰，绿原酸吸收强度最低，其原因是因为绿原酸只有一个苯环。1396cm-1= C-O-C的反对称和对称拉伸振动，吸收峰在1201 cm-1处对应的是醚中碳氧的拉伸振动。吸收峰在1199 cm-1对应的是不饱和酮羰基的平面内摆动，而790 cm-1处对应的是苯平面外弯曲振动。
2．3计算制备单体的制备率
将多种粗提取物进行合并，总计500毫升。绿原酸浓度为0.5018mg/mL、芦丁为0.1578mg/mL、异槲皮苷为0.3694mg/mL、紫云英苷为0.068 mg/mL。因此可以得出结论，每500毫升的溶液中绿原酸量为250．9mg、芦丁量为8．9mg、异槲皮苷量为182．45mg、紫云英苷量为34mg。把500 mL粗液体浓缩至20 mL后，连续两次在半制备型色谱中进样，对相应的馏分进行收集并合并，在冷冻干燥后，然后根据式（2）对各组分得率进行计算，将质量设置为W，结果如下所示。
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3.实验结果：
（1）在流动相为乙腈时，分离效果高于甲醇，并且最终分离纯化条件是：流动相是乙腈和0.5％磷酸水溶液，体积比20:80，进样量和流速分别为10 mL、20 mL/min。
（2）异槲皮苷可以通过一次HPLC分离获得，同时还可以分离出其他三种活性物质（绿原酸，芦丁、紫云英苷），纯度均在98％以上，制备率分别为26.36％、 30.37％、19.51％、11.47％。
（3）制备样品所需的乙腈消耗量费用为14.4元，本实验中制备的单体量预测效益在3091元左右。
结束语
目前，在我国最为成熟且使用面广的分离纯化技术为制备型高效液相色谱。其具备较多应用优势，如高纯度、高产率、高分离速度。目前，我国桑叶的开发利用只是一种预处理粗加工，它们中大多数是复方制剂，天然活性成分单体不经常使用，这直接对桑叶高附加值提取物的经济推广造成制约。因此，筛选和开发高活性成分的桑叶，可以提高桑叶的利用率，以满足不同群体的需求。
参考文献：
[1]张颖，桑叶有效成分及抗肿瘤作用研究进展[J]，李世珍中药材，2018（9）：2223-2224
[2]张国权，蔡晓燕，张彦杰，桑叶食品的研究进展[J]，农产品加工，2017（13）：43-45