摘 要：移液器因其简便的操作方法和准确的取样量程已广泛应用于精液检测实验中。移液器与其它精密仪器一样，都具有其特定要求的操作和养护规范。在精液质量检测中，规范的移液器操作技术能有效提高移液的准确性，获取真实客观的实验结果，还能延长移液器的使用寿命。但在移液器的使用过程中很多影响检测结果准确性的操作细节常常被忽略，造成移液误差。本文拟对移液器在精液检测中的正确的使用、维护和校准等方法作一简述，以期为从事精液品质检测的同行提供参考。
关键词：移液器的分类；正向移液技术；反向移液技术；精液质量检测；正确使用；保养方法
中图分类号：G482 文献标识码：A
Abstract: Pipettes are widely using in semen testing for the convenient operation and the accurate sampling amount. Using pipettes, like using other precise instruments, need follow a specific protocol for operation and maintenance. In semen quality testing, the canonical operation of pipettes can improve the accuracy effectively, get the real and objective results, and prolong its service life. However, while using pipettes, many details affecting the pipetting accuracy are usually been overlooked and result in an artificial errors. The aim of this paper is giving a brief description of the canonical way of using, maintenance and calibration of the pipettes in semen testing, providing a reference to the peers which are engaged in semen quality testing.
Key words: Pipette classification; Positive pipetting; Reverse pipetting; Semen quality test; canonical operation; Maintenance
在对原精样品进行检测前必须要先作稀释。用于检测的精液稀释剂和精液样品量都非常小，即使是很小的抽样误差都会对检测结果产生显著影响。因此需要对原精作非常准确的稀释才能获得可靠的结果。手动微量移液器是最常见的用于精液抽样和稀释精液的仪器。与所有的精密仪器一样,若采用正确的操作技术使用移液器，并在使用过程中注意所有的操作细节，其结果有很强的可重复性[1]。不幸的是,在实验过程中正确的移液器操作技术和必须注意的细节常被忽视,且移液仪器的定期校准和适度保养均变得可有可无[2]。为确保检测结果的一致性，各精液品质检测实验室应采用标准的移液技术和操作程序，并对所有的仪器和操作人员进行定期培训和人员比对。
1.移液器的分类
自1956年德国科学家Heinrich·Schnitger发明可调式移液器至今，移液器已发展出繁多的种类，其分类方法也各不相同。
根据移液器的物理学原理可分为空气置换式移液器（或气体活塞式，Air displacement）和正向置换式移液器（或外置活塞式，Positive Displacement）两种。空气置换式移液器适用于标准溶液移液，例如水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液。其活塞位于移液器的内部，通过活塞的伸缩改变空气体积，同时产生压力从而提供液体移动原动力即液体的吸取或排放，活塞与液体不接触。正向置换移液器主要应用于黏稠度较大的液体如糖浆、甘油等，易挥发溶液，易产生气泡的液体的移液。需要配合专用的吸头使用，其活塞位于移液器外，置于吸头/毛细管内部，通过活塞的伸缩引起液体的移动。活塞与液体直接接触，两者之间没有空气段，可以更好地保护液体样本，最大限度地避免交叉污染，能提高粘滞液体吸入或排出量的准确性和精密度。
根据移液器所用动力分，可分为手动移液器和电动移液器。
根据移液器所带吸头的数量分，可分为单通道移液器和多通道移液器。
精液检测实验室常用的移液器为手动单道移液器。这是一种量出式量器，其移液量是由一个配合良好的活塞在活塞套内移动的距离来确定。主要由显示窗、容量调节部件、活塞、O-形环、吸引管和吸头（也称枪头）等部分组成。
2. 手动单道移液器常用的移液技术
移液器的正确操作技术是完成科学试验的第一步，错误的操作容易产生移液偏差，导致实验结果不准确。在精液检测中因为原精稀释倍数大，取样量小，检测人员必须掌握正确的移液技术，减少检测结果的误差。
2.1正向移液技术
空气置换式移液器的操作按钮有两个位置:第一停点和第二停点。如图1所示，当使用正向移液技术吸液时,先用大拇指将操作按钮按下到第一停点（1.准备），再将移液吸头浸入到样品中,然后缓慢释放操作按钮回原点，吸入所需要的样品量（2.吸液）。吸出样品后，需要用吸水纸吸干吸头外多余的样品，以确保移出的样品量为实验所需要的设定量。排液时，先将吸头紧贴容器壁，按下操作按钮到第一停点，排出吸头内的样品（3.排放一）。为了让吸头内的样品全部排完，操作按钮的第一停点稍加停顿后，还需继续将操作按钮按压至第二停点（4.排放二），排尽吸头内所有样品后再缓释放操作按钮回弹至原位，最后松开按钮（5.复原）。
正向置换式移液器只能采用正向移液技术进行操作。
.png)
图1 正向移液技术操作示意图
2.2反向移液技术
反向移液技术一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量的液体。
如图2所示,当使用反向移液技术吸液时,直接将操作按钮压至第二停靠点(1.准备)，再将吸头浸入样品液面，同时控制操作按钮缓慢回弹至原位，再松开操作按钮，吸入所需要的样品量(2.吸液)。 排液时，先将吸头紧贴容器壁，把操作按钮按至第一停点，排出吸头内的样品(3.排放)，随后将吸头顶部剩余的样品废弃或还原至容器，释放操作按钮至原点(4.复原)。
图2.反向移液技术操作示意图
3.精液检测中适用的移液器和移液技术
精液稀释剂一般是普通的盐溶液，可以用空气置换式移液器和正向移液技术进行操作。不推荐用反向移液技术移取水性溶液，因为这个技术在吸取水性溶液时，吸取的样品量往往会超过仪器校准时确定的量。
无论是原精还是稀释精液都属于黏性液体，在取样移液时应对其进行特殊考虑。使用空气置换式移液器和正向移液技术对精液样品进行取样时可能会产生不准确的结果，因为吸液时，精液会在吸头的内壁形成一层薄膜，导致排液时样品不能完全从吸头内排尽。因此，在移取精液样品时推荐使用正向置换式移液器或空气置换式移液器的反向移液技术。
移取精液样品时，先将液体吸入，再打出，重复2～3次进行吸头浸润，致吸头内壁吸附一层液体，使吸头内表面达到饱和，最后将吸取的精液样品移至目的容器，这样操作吸取的样品体积会更准确，特别注意在排液前要仔细擦干净吸头外壁的液体。
4. 精液检测中的移液器使用技巧
4.1量程的选择和调节方法
首先要根据取样量选择合适量程的移液器。虽然移液器的可用量程范围是移液器最大量程的10～100%，但移液体积越接近所选移液器的最大量程，移液的准确性越好。如需要取样70μl，最好选择最大量程为100μl的移液器，而不用最大量程为200μl的移液器。
调节量程的正确方法应为：当移液器的量程需要从大体积调为小体积，按照正常的调节方法，即逆时针旋转旋钮至目标量程即可；当移液器的量程需要从小体积调为大体积时，则可先顺时针旋转刻度旋钮至超过目标量程的刻度，再回调至目标量程，这样可以保证量取的最高精确度。这样的操作可以排除移液器内部机械间隙造成的影响，使移液更加准确，而且整个调节过程要注意动作轻缓。
特别注意，千万不能将调节旋钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置而损坏移液器。
4.2吸头填充方法
在精液检测实验中，检测人员常习惯将移液器下端垂直插入吸头，并上下强力敲打吸头，以期使吸头紧密地填充上紧。但这种填充吸头的方法会影响移液器的气密性导致吸液不准，长期如此操作还会造成移液器内部零件因经常性的撞击而松散，甚至会导致调节刻度的旋钮卡住，影响移液器的使用。
填充吸头的正确方法为将移液器下端垂直插入吸头，左右小幅度旋转上紧即可。
4.3浸润吸头有利于提高精液取样准确性
移取精液样品时，由于精液有一定的黏稠度，会在吸头上形成挂壁现象，因此移液时最好先润洗吸头[3]。具体方法是吸液时先将液体吸入，再打出，重复2～3次进行吸头浸润，这样吸头壁会吸附一层液体，使吸头内表面达到饱和，再吸液后排出的体积会更准确。浸润过程还可以帮助检查是否有气密性不好导致的漏液现象。
吸液后，保持吸头在液面下停留几秒，使移液器的弹簧充分回弹至设定位置再把移液器拿出，可以提高吸液量的准确性，避免因弹簧回弹不充分，吸头下方进入部分空气和气泡影响吸液的准确性。
4.4吸头取样角度和浸入深度
移液吸头浸入液面的角度不同对移液效果也会有影响，刘丽通过[1]实验证明垂直加样是准确度最好的吸液角度。同样移液吸头浸入液体的深度对移液量也会有一定的影响。浸入过浅，可能会吸入空气，导致移液量不准；浸入过深，可能会因为额外增大的压力致移液量偏高。刘丽的实验结果显示吸头浸入深度在4～10mm时比较，吸取血清、水、异戊醇和无水乙醇的变异系数分别为0.12、0.09、0.39和0.24，远小于浸入深度<4mm和>lOmm的结果。说明移液时吸头浸入液面达到4～10mm时吸液准确性明显提高。
4.5吸头吸液的速度
移液器取样时吸液的速度也很关键，如果吸液过快会产生反冲和气泡影响移液的准确性，有的还会将液体吸入活塞，造成再次使用时交叉污染，严重时还会造成移液器漏液，活塞和密封圈损坏H』。所以正确的操作应该是缓慢吸液，这不仅可以使实验准确还可以延长移液器的使用寿命。
4.6移液器的放置
移液器使用完毕，应将量程调至最大刻度，再竖直挂在移液器架上。
当移液器枪头里有液体时，切勿将移液器水平放置或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。
5.精液检测实验室移液器的维护与常见故障处理
在精液检测实验中使用移液器需要适当保养，且遇到常见故障要学会处理。
（1）气密性检测 将吸取液体后的移液器垂直静置15秒，观察是否有液滴缓慢的流出。若有流出，说明有漏气现象。
（2）移液器漏气的处理 如果有漏液则更换吸头后再试，如果继续漏液须更换移液器再操作。漏液的移液器需送到专业部门进行检修。
（3）准确性检测
量程小于1μl：建议使用分光光度法检测。
量程大于1μl：用称重法检测。通过对水的称重，转换成体积来鉴别移液器的准确性。
送至有资质的计量监测机构作专业校准。
参考文献(References)：
［1］刘丽,董成亚,李昊文, 等.可调微量移液器良好操作规范探讨[J].标记免疫分析与临床,2014,(6):765-769.
［2］Brito L F. A multilaboratory study on the variability of bovine semen analysis.[J]. Theriogenology, 2016, 85(2):254-266.
［3］佟林,王金涛,刘子勇.移液器使用及校准过程中影响因素分析[J].中国计量,2012,(5):79-81. []
作者简历：王洪飞（1984-），女（汉），硕士，主治医师，主要从事肿瘤病理学诊断