沈观兴 骆义英
吴川市动物疫病预防控制中心 广东吴川 524500
摘要：本文对鸡群的鸡传染性腺胃炎进行病因探究，通过生产数据分析、临床观察、病理剖检，并采集病料进行实验室检测，应用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、SPF鸡胚培养，血凝实验等方法对采集的病料进行检测。结果为网状内皮增生症病毒（REV）阳性，病毒无血凝性。本研究结果为该病的诊断及后续防治提供了一定的参考。
关键词：鸡；传染性腺胃炎；RT-PCR
鸡传染性腺胃炎是一种以腺胃肿大，腺胃乳头出血、溃疡为特征的肉鸡传染病，该病多发于雏鸡，不同品种及日龄的鸡均有发病，主要表现为生长停滞、羽毛生长不良和消瘦，且病程长，死淘率高，严重影响养鸡业的经济效益。
1 实验方法
1.1 SPF鸡胚接种
接种前的准备，将鸡腺胃组织加入PBS进行研磨成匀浆，并置于离心机中进行5000r/min转速下离心五分钟，取上清在超净台中用滤器过滤细菌。
照蛋以铅笔划出气室、胚胎的位置。
用锥子在酒精灯火焰烧灼消毒后，在气室顶端和气室下沿无血管处各钻一小孔，随后利用注射器吸取过滤后的上清以及鸡新城疫病毒阳性血清，针头从气室下沿小孔处插入，深1.5cm，即已穿过了外壳膜且距胚胎有半指距离，注射量0.1mL。注射后以石蜡封闭小孔，置37.5℃恒温箱中直立孵育。
1.2 SPF鸡胚观察 接种24h后，每天照蛋2次，观察是否可见清晰的血管，明显的胎动，以及血管网是否丰满。
第一，1%红细胞制备。由鸡翅下静脉无菌采取抗凝血10ml；1000r/min离心5min，吸弃上清液体及白细胞层；加入适量PBS重悬清洗，1000r/min离心5mim，吸弃上清液体及白细胞层；重复前一步骤2次；最后一次吸弃上清后沉淀即为红细胞，吸取1ml红细胞加入99ml PBS重悬即制得1%红细胞悬液，于4℃保存。
第二，血凝实验。用PBS（生理盐水）铺板：采用50ul体系进行试验。调节移液器至25ul，吸取PBS缓冲液加入96孔血凝板中；倍比稀释：吸取25ul待检样品（为收集的鸡胚尿囊液）依次加入第1纵排孔中，吹打15下后吸取25ul再加入第2纵排孔，再吹打15下，吸取25微升加入第3纵排孔中，依次类推，直至第11纵排孔，吹打混匀后吸25ul后连同吸头一起弃去，最后一纵排为阴性对照。每块平板的第一横排均为鸡新城疫病毒阳性血清对照；加红细胞：加1%红细胞，每孔25微升，然后置于37℃温箱反应40分钟，观察结果。
第三，引物。IBDV引物1：上游引物IBVS1F1（5’to 3’）：TTAAATGGTGATCTTGTT,
下游引物IBVS1R1（5’to 3’）：AGTAAAAGGATAAAAGCC；IBDV引物2：上游引物IBVS1F2（5’to 3’）：AGATGGCTTTTATCCTTT,下游引物IBVS1R2（5’to 3’）：CCACCAGACACTACAAAC。
第四，病料基因组提取。
使用Takara Viral RNA试剂盒提取RNA，取10mg病料进行液氮研磨，之后加入200μL PBS溶液或RNase free H20；加入200μL的Buffer VGB,20μL的Proteinase K和1.0μL的Carrier RNA充分混匀于56℃水浴温浴10分钟；向裂解液中加入200μL无水乙醇充分吸达混匀；将spin column安置于collection Tube上，溶液移至spin column中，12000rpm离心2分钟弃滤液；将500μL的Buffer RWA加入至spin column中，12000rpm离心1分钟弃滤液；将700μL的Buffer RWB加入至spin column中，12000rpm离心一分钟弃滤液(请确认Buffer RWB已经加入了指定体积的100％乙醇，请于spin column管壁四周加入Buffer RWB这样有助于完全沾附于管壁上的盐分）；重复上一步操作步骤；将spin column安置于collection Tube上，12000rpm离心2分钟（空离）；将spin column安置于新的1.5mL RNase free collection Tube上，在spin column膜的中央处加入30-50μL 的RNase free dH2O。室温静置5分钟；12000rpm离心2分钟洗脱RNA。
第五，cDNA的制备。将提取的RNA按照逆转录试剂盒说明书进行操作，先加入5ul的RNase free H2O，之后加入1ul的Random hexamers与2ul的总RNA（约500ng），65℃加热5分钟，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min，最后加入10ul的2X RT Mix和2ul的HiScript II Enzyme Mix，用移液器轻轻吹打混匀。按照以下程序进行第一链cDNA合成反应：25℃保持5min；50℃保持45min；85℃保持2min。
2 结果与分析
2.1 临床症状，病理变化以及统计数据
临床检查发现发病鸡多呈现冠髯苍白、萎缩，可视粘膜苍白，腹部肿大，腿部皮肤发绀、触摸发凉等症状。
病理剖检发现部分病鸡腺胃肿胀，呈乳白色，腺胃壁增厚、水肿，切开后自然呈月芽状蜷曲，指压可流出浆液性液体。腺胃黏膜肿胀变厚，乳头肿胀呈不规则突出、变形。粘膜出血、溃疡，有的乳头已融合，界限不清。肌胃胃壁有溃疡和增厚症状。
采样肉鸡养殖场的死淘情况：自6日龄起雏鸡死亡率突然增加，且高居不下，病鸡均腹部肿大且腹部发绀。符合鸡传染性腺胃炎流行特点。
2.2 SPF鸡胚接种培养结果
SPF鸡胚接种后置于恒温温箱培养，每日照蛋观察，持续一周，除作为阳性对照的鸡胚（接入鸡新城疫病毒阳性血清）全身出现出血点现象外，鸡胚均正常，无死亡及病变现象。培养结束后收集已接种病样的鸡胚尿囊液，用为之后血凝实验的样品。病样鸡胚本应传代培养3代，因病样接种的鸡胚均无出现死亡现象，故在实验过程中只进行了一代的鸡胚培养。
2.3 血凝实验结果
用收集的鸡胚尿囊液进行血凝实验，检测病原是否具有血凝性，以此缩小病原范围，实验中阳性对照为鸡新城疫阳性病毒血清。第一组为鸡新城疫阳性病毒血清，出现明显血凝现象，而加入病样尿囊液的孔红细胞均沉淀至孔底，故病样所含病原并不具有血凝性。
3 讨论
本实验提取病毒基因组采用的是Takara Viral RNA试剂盒。为进一步提取更多量的核酸，并增加提取核酸的反应性，可采取下列措施：在使用Buffer RWA和 Buffer RWB清洗膜的时候，沿Spin Column的管壁四周加入，这样可提高清洗效果，使清洗更彻底；在最后一步向Column中加洗脱液之前，要将Column在室温下静置足够长的时间除去残留的乙醇。
综合以上情况，对该肉鸡养殖场提供以下防治建议：第一，目前，还没有有效的药物针对鸡传染性腺胃炎进行治疗，应对鸡群采取严格的生物安全措施，保持鸡舍良好通风条件，减小肉鸡的应激。同时时刻注意鸡舍的温度。卫生与消毒工作也应贯穿于养鸡生产的每一个环节。第二，鸡群引种，尽量选择合作过并且没有发生过鸡腺胃炎的企业购买鸡苗。因鸡传染性腺胃炎具有很强的地域性，故也必须从没有发生过鸡腺胃炎的地区的种鸡场引种。采样批次发病较以往批次严重，极有可能是因为更换了鸡苗供应的企业。第三，非传染因素的病因也要给予重视，鸡饲料要经常检查是否发霉，饲料霉菌毒素过高也极容易引发疫病。第四，可适量减少饲料中硫酸铜的添加量，硫酸铜虽价格低廉且具有促进生长，抑制真菌的作用，但高浓度的硫酸铜会刺激禽胃肠黏膜，以致腺胃黏膜出血，呈淡绿色；肌胃糜烂、坏死等临床症状。
参考文献
[1]刘国荣. 鸡传染性腺胃炎的免疫学研究[D].聊城大学,2015.
[2]刘国荣,刘文强,刘芳芳,刘豪.鸡传染性腺胃炎的流行及病因分析[J].中国畜牧兽医,2014,41(10):257-260.
[3]李静,杨兰芝,段纲.浅谈鸡网状内皮组织增生症及其防控措施[J].中国畜牧兽医文摘,2017,33(06):148.