梁岩岩 许亭辉
中检集团公信安全科技有限公司 山东枣庄 277100
摘要：食品安全是一个越来越引起人们重视的问题，不仅影响到人们的生活、工作和健康，更是关系到国计民生的大事。在各种食物中毒中，细菌性食物中毒是食物中毒的主要因素。多重PCR是通过在同一个PCR反应体系中，引用多对引物，同时完成多个特异性目的基因片段的扩增方法，具有高效、系统、经济简易的优点。本文对多重PCR技术在食品病原细菌检测中的应用进展进行了综述。
关键字：多重ＰＣＲ；食品检测；肉类；病原微生物
食源性疾病原的检测技术是食源性疾病的预防与控制的关键技术环节。目前我们国家虽然制定相关的食物中毒病原菌检验方法，由于检测方法均采用经典、耗时较长的方法，且存在国内试剂供应不配套等问题，很难适应公共卫生事件应急处理快速反应的需要，随着时代的进步，检测方法的先进性、灵敏度、特异性要求都更高。分子生物学检测技术的发展，为微生物食物中毒快速检提供了良好的技术平台。
1原理及技术特点
PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶莲式反应，是1985年美国科学家Mullis发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。原理是首先将靶DNA双链加热变性为单链，然后加入两段人工合成的与靶DNA两端正邻近序列互补的寡核苷酸片断作为引物（Primer），即左端引物和右端引物；该对引物与互补的DNA单链碱基互补结合后，在有DNA聚合酶和4种dNTPs底物存在的情况下，引物沿模板DNA链按5’→3’方向延伸，自动合成新的DNA双链。新合成的DNA双链又可作为扩增的模板，继续重复以上的DNA多聚酶链反应。经过25~35次循环，可将靶DNA序列扩增近百万倍。PCR技术最早应用于基因克隆和转基因检测，但由于其准确、微量的特点，已经广泛应用到其他领域。随着对一些主要食品微生物遗传性质了解的逐渐深入，许多致病菌的遗传背景进一步明了，PCR技术在食品检测中也逐渐显示出其应用前景。利用PCR技术从食品中检测病原微生物近几年才得到比较广泛的应用。
多重PCR是在常规PCR基础上发展起来的原理与常规PCR基本相同，只是在同一反应体系中加入一对以上的特异性引物，如果存在各对引物特异性互补的模板，则可以同一反应管中扩增出一条以上的目的DNA片段多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术，是在同一反应体系中加入多对引物同时扩增多功能条目的DNA片段的方法，采用这一技术可同时检测多种病原微生物。该技术已经在遗传病诊断、转基因鉴定、病原体检测等各个领域成功的得到应用。
2主要流程及影响因素
多重PCR的各反应条件均能不同程度的影响扩增反应的结果，其中退火温度及各引物浓度配比为主要影响因素。各引物在反应中成竞争关系，目的片段种类越多，引物间竞争越激烈。在一定范围内，该引物在体系中使用的量，与电泳结果中其目的条带的明亮程度成正比关系，然而使用过多会导致对其他引物的抑制。这是由于在反应中，酶与dNTP的供应量是有限的。一只在前儿个循环中，某一产物的量远远大丁另外的产物，在之后的指数级扩增中，其他的扩增产物的量就变得相对微弱了，这是引起多重PCR假阴月性结果或灵敏度降低的重要原冈。所以，扩增反应最后的成功，需取决一定程度的经验积累和摸索。
2.1引物设计
PCR引物对扩增的特异性起着关键的作用，引物的优劣直接关系到PCR扩增的特异性和成功与否。引物位于待分析基因组中的高度保守区域，长度为18~30个碱基为宜。多重PCR引物对的最适退火温度要尽可能的相同，这样有助于多重PCR选择的退火温度保证每对引物都有相同的扩增效率。应尽量确保所有引物间没有任何形式的相互作用，在引物设计时可通过分子生物学软件进行分析。扩增产物的大小要能通过电泳或其他方法区分开。
2.2模板提取
PCR检测方法的可靠性一部分依赖于目标模板的纯度和足够的目标分子数量，模极量太少，会出现阴性结果或条带很弱：模扳量太多则会出现条带弥散，模糊不清；模扳纯度低或被降解会导致扩增的不整齐。
根据研究，模板提取方法的差异与操作不当亦可以导致扩增失败。提取效率的差异，直接影响着检测的灵敏度。据国内外学者研究chelex–100离子交换树脂提取细菌DNA的效果良好。该法具有提取纯度高、速度快、操作简便、高度灵敏、低成本等优点，弥补了传统方法提取效率低、长时间高温引起DNA降解、产物中杂质成为TaqE的抑制剂、抽提过程DNA损失较多等缺陷。多重PCR方法在大规模投入食品检测的应用之前，尚需在这方面做进一步研究。
2.3TaqDNA聚合酶
多重PCR反应体系中同时存在多个DNA扩增反应，不同反应之间对Taq酶存在竞争，这种反应之间的竞争会使效率相对较低的DNA扩增受到很大程度的抑制。在多重PCR体系中适当多加入一些Taq酶可减弱竞争产生的抑制作用，但Taq酶过多则极易造成非特异性扩增。通常可根据不同产品的说明书为基础进行凋整优化。
3多重PCR在食品安全检测中的应用
3.1多重ＰＣＲ在肉类检测中的应用
肉制品是人体蛋白质和微量元素的重要来源。我国是肉制品的生产和消费大国，肉制品在居民食品消费中占有很大比例。目前全球的肉制品的安全状况令人担忧，比如欧洲的马肉风波，我国江苏地区羊肉掺假事件等，都暴露了严重的食品安全问题。由于肉制品的品种和价格差异，不法商贩以低价肉类代替高价肉类出售，不仅损害了消费者的利益，而且存在食品安全风险。传统的依靠感官与形态的肉类品质鉴别方法已经无法满足对上述掺假现象的控制和监管需要。
以多重ＰＣＲ为基础的肉类成分鉴别技术具有检测通量高、仪器设备简单、操作方便且检测费用低的优点，它解决了传统方法中由于蛋白质变性而失能的困难，还可以鉴定肉加工类样品。目前，针对鸭肉、猪肉、鸡肉和马肉等可能掺假肉类的检测已经成熟。张全芳等根据动物线粒体１６ＳｒＲＮＡ基因的差异性位点，设计特异性引物，通过优化ＰＣＲ反应体系，建立了正向引物共用、反向引物特异的ＰＣＲ反应体系，一次ＰＣＲ反应可同时扩增出三个不同物种（绵羊、山羊、狐狸）的特异性片段。该方法具有较高的灵敏度和准确度，且操作简单易行。杨冬燕等建立可同时检测羊肉中掺入的猪、马、牛、鸭成分中的任意２种，及牛肉中掺入的猪、马、鸭成分中任意２种的双重ＰＣＲ检测体系。方法配制掺入猪、马、牛、鸭源性成分的模拟掺假羊肉样品及掺入猪、马、鸭源性成分的模拟掺假牛肉样品，每个成分的掺假比例为１０％。筛选特异性强、敏感度高的猪、马、牛、鸭物种特异性基因，优化反应体系，建立了针对猪、牛、马、鸭两两配对的双重ＰＣＲ检测体系。结果无论是模拟牛肉掺假样品，还是模拟羊肉掺假样品，所有掺入的低价肉品成分都被准确检出，且无非特异扩增条带。该研究建立的双重ＰＣＲ检测体系，可以敏感、特异、准确的检出牛、羊肉制品中的猪、牛、马、鸭成分。
3.2多重ＰＣＲ在食品病原微生物检测中的应用
诊断病原体的常规方法主要有细菌培养、细胞培养、电镜观察、核酸杂交、酶联免疫及聚合酶链反应。但这些检测方法都存在着不同的缺点，比如检测周期长、敏感度低、价格昂贵、技术条件要求高、工作量大、只能检测单一病原体等，在实际应用中很难在短时间内处理大量的样品。多重ＰＣＲ灵敏快捷，适于大规模检测，能同时进行多种病原微生物的鉴定。
4存在问题和技术展望
多重PCR在实际应用中一旦有极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果；多对引物同时扩增，各种试验条件控制不当，很容易导致扩增失败或非特异性产物；引物的设计及靶序列的选抒不当等都可能降低其灵敏度和特异性。此外，对食品样品进行检测时，增菌培养基选择不当易使有的细菌生长缓慢或被抑制，导致假阴性的结果。今后的技术发展尚需延伸：（1）DNA模板的提取和纯化方法。（2）反应条什的优化。（3）增加反应引物对数，真正实现高通量。（4）与其他分子生物学技术相结合。
参考文献：
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