韩照辉 陈维嘉 明恒波
青岛易科检测科技有限公司 山东青岛266000
摘要：随着全社会环保意识的逐渐提升，居民对于环境微生物污染的重视程度也在不断提升，由于环境微生物的检测流程相对复杂，影响因素较多，给质量控制造成了较大的困难。本文的研究从环境微生物检测的全流程入手重点探讨了质量控制的手段。
关键字： 环境微生物，监测技术，质量控制
1 引言
作为环境检测中一个较为特殊的检测项目，环境微生物检测的难度突出表现在微生物的多样性和生物性上，样品中微生物的数量随着外部条件和时间的推移会产生较大的差异。环境微生物检测对于检测人员的操作水平要求较高，检测质量要求高，可重复性较差，样品保存时间较短，国内尚未有成体系的、系统化的环境微生物检测技术规范和质量控制手段。本文在参考相关国家标准和行业规范的基础上，探讨了环境微生物检测过程中采样、设备、仪器使用、检测方法等技术要点及相应的质量控制措施，对于该领域工作人员具有重要的借鉴意义。
2 环境微生物检测采样前准备分析
在环境微生物检测的采样环节，如进行水质样品的采集，则推荐使用带有瓶盖和塞具的玻璃容器，并在使用前对其进行彻底的消毒，常用的消毒方式包括湿热和干热两种，干热灭菌建议使用电热干燥箱，要求温度在160~200摄氏度之间保持两小时，湿热灭菌仪器可使用高压灭菌锅，在120℃以上及相应压力条件下，建议保持30分钟以上。采样容器在灭菌后应进行密封保存，直至采样环节开始，以免造成样品污染。使用过后的采样容器，如样品中的微生物浓度过大，应进行相应的灭活处理，避免对环境造成影响。如果是采集土壤或者是固体样品，推荐使用广口玻璃瓶，灭菌及保存要求可借鉴水质样品进行，采样完成后，可使用牛皮纸包裹瓶口。
在使用采样容器进行环境微生物样品采集时，应提前对容器进行消毒和杀菌作业，消毒方法和程序可参照样品容器消毒。如果条件限制，无法进行整套的消毒杀菌，可使用75%乙醇重点对可能接触样品的部分进行消杀。采样容器在消杀之后，应保存在洁净的专用包装袋中，运至采样现场。
3 样品的采集与运输
在样品采集完成之后，应选择具有代表性的样品运输到检测单位。微生物采样的规划工作主要包括点位的选择，点位确定对于保证样品的代表性具有重要意义。在此基础上，为了保证样品在采集和运输过程中没有受到环境因素或人为因素的污染，应尽可能减少人及其他环境因素的直接接触。同时运输环节应保持在避光低温的环境，建议温度在0~4℃之间，可使用车载冰箱进行保温。工作人员应尽快将样品送到实验室进行分析，最长时间不应超过12小时。
4 环境微生物检测技术及质量控制手段
平板计数法、滤膜法和MPV法是实际工作中常用的微生物检测手段，其中平板计数法适用范围较广，在液体环境和固体环境中均适用，也可用于计量空气中悬浮的微生物数量和菌落总数。该方法的主要优势在于操作简便，适用范围广，后期微生物的分离和纯化效率高，缺点在于微生物的检出下限较高，对于低浓度的微生物经常无法检出。MPV法主要使用统计学原理，计算环境中微生物的浓度，根据使用介质不同又可细分为多管发酵法和纸片法。
纸片法的优势在于检测速度快，缺点在于只适用于水质样品，同时容易受到还原性物质和ph值的干扰，假阴假阳的现象无法完全避免。多管发酵法适用性较广，特别是在低浓度微生物的检测中较为适用，常用于特定菌群的检测。对于高浓度的样品，需要经过多倍稀释，所以在操作之前应对原样品进行经验估计，同时对于出现阳性反应的管，应做进一步的检测和确认。
最后，对于水中微生物的检测还可使用滤膜法，但是滤膜法要求水中悬浮物及杂质含量低，常在纯净水和饮用水的微生物检测中使用，优势在于检测样品量大，结果的代表性较好，同时检出限较低。
采集的样品应通过传递窗进入微生物实验室，保持人和物的分流。在传递窗中，应保证30分钟以上的紫外消毒。测试人员在进入微生物实验室时，应严格执行自身净化规程，主要包括更换洁净的衣服，佩戴口罩及手套，换鞋的等。无菌室内的仪器和设备及使用的主要工具和材料，应使用75%的酒精消毒或使用紫外线照射30分钟以上消毒。在采集样品开封之前，应对周围环境进行消毒，避免污染。同时操作过程中使用的吸管不能混淆使用，对于不同样品或者是不同稀释倍数所使用的吸管避免交叉使用。操作人员应避免在操作过程中接触到稀释液样品和培养皿等。在环境微生物检测过程中，在应检验区域放置一个空白培养皿，空白培养皿的作用是记录检测过程中的空气沉降微生物。检测完成之后，应做好工作台及地面的清洁卫生工作，并进行紫外消毒。
样品检测过程中应设置空白对照组，空白组不做任何的处理，对于没有空白对照组的检测，应判定检测结果无效并进行重新测定。微生物检测实验室应定期进行阳性及阴性对照菌的检测、检疫工作，对照试验应按照同一个检测方法和检测环境进行。一旦出现阳性菌株检测得到阴性反应或者阴性菌株出现阳性反应，则与之对应的检测结果无效。对于阴性反应不明显的样品，检测人员应进一步筛选典型菌落进行培养，直至得出确定结果。条件较好的检测单位应开展对比试验，进一步验证检测结果的准确性。
5 检测实验室洁净度控制分析
检测实验室的内部布局和空间设计应以微生物实验室操作安全要求和质量控制相关规定为依据，既有最大程度的防止微生物污染，同时又要保证检测设备和人员的安全。一般环境微生物，为满足检测的质量要求去操作台的洁净度应在100级以上，背景的洁净度应在1000级以上。与此同时，在使用前需对操作环境进行紫外消毒，杀菌消毒，杀菌的时间应在30分钟以上，在操作完成之后可使用乙醇或者是相应的杀菌溶剂对相关区域和操作台进行清洁。值得注意的是，杀菌消毒溶剂需轮换使用，避免微生物出现耐药性，导致灭菌效果下降。
环境检测微生物实验室的日常管理中，应保证环境清洁度达到检测要求，保证检测结果的可靠性，主要的检测指标包括过滤器完整性能测试，换气次数及风速测试，悬浮离子或沉降菌数量控制等，相应的检测方法可依据国家标准进行。
6 培养基质量控制
培养基质量控制的作用是提升检测结果的准确性，并满足待检测微生物培养的基本要求。如果检测单位使用成批采购、自制的培养基，在使用之前应进行适用性检测，设置对照实验组，并在对照组和实验组中分别使用标准菌液进行对照培养计数工作，两组实验结果的比值范围应在0.5-2.0之间，否则表明配置的培养基不合格。培养基在配置完成之后应保存在0~4℃的恒温环境中，保存期限可参照稳定性测试结果确定。
7结语
近年来环境检测及环境保护工作引起了人民群众和全社会的关注，如何准确的获取环境数据，是评估环境污染及制定相应环境保护措施的基础工作。对土壤，水体和大气的监测技术较为成熟，但是环境微生物的检测，可重复性较差，数据误差较大，其主要原因是受到微生物特性的影响，微生物在采集运输及检测过程中，极易受到外界条件的干扰，样本采集点是否合理，采集过程的容器是否受到污染，运输过程及微生物检测实验室的清洁程度，检测工作人员的操作质量，都会在一定程度上影响监测数据及监测结果。为此加强环境微生物监测技术质量控制手段的研究，具有极为重要的现实指导意义。本文从环境微生物检测的主要工作流程入手，探讨了采样前准备采样和运输检测及清洁度控制等关键节点的质量控制方案，对于该领域的工作人员具有重要的借鉴意义。
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