陈义萍1,,蒋林奇[]1,于梦婷1,陈勋1,杨贤英1,郑钦芳2,刘雨2,蔡世昌1*
1.湖南医药学院 医学院 湖南 怀化 418000；2.湖南医药学院 侗医药研究湖南省重点实验室 湖南 怀 化 418000
【摘 要】：目的 观察人头藤对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。方法 采用线栓法结扎单侧（右侧）颈总动脉制备大鼠急性脑缺血再灌注模型,通过观察侗药人头藤对局灶性脑缺血大鼠行为障碍及对大鼠脑缺血再灌注后脑组织中SOD、GSH-Px酶活性和MDA含量的变化，观察人头藤对大鼠脑缺血再灌注后的影响。 结果 人头藤（80mg/kg）腹腔注射给药可明显缓解大脑中动脉栓塞致脑缺血大鼠的行为障碍，使脑缺血再灌注后脑组织中SOD（p <0.01）、GSH-Px(p <0.01)酶活性升高和MDA(p <0.01)含量降低。 结论 侗药人头藤对大鼠脑缺血再灌注所引起的神经损伤有一定的保护作用。
【关键词】人头藤；脑缺血再灌注损伤；神经保护作用；抗氧化
【中图分类号】R29
人头藤（kadsura coccinea），又名黑老虎，侗医药取其藤茎入药，称为人头藤。其化学成分主要包括木脂素类、三萜类、单萜类、倍半萜类、氨基酸等，其提取物中的花青素和多酚类成分具有抗氧化作用[1-2]。有研究证实人头藤还具有抗肿瘤作用[3]。Yang等[4]研究表明，南五味子中的联苯环辛二烯类木脂素化合物ananolignan F、L在体外实验中表现出较强的神经保护作用。但其对大脑再灌注后脑损伤的保护作用尚见报道。本研究通过测量大鼠脑缺血再灌注后脑组织中SOD、GSH-Px酶活性和MDA含量的变化,观察其对脑缺血后再灌注后的神经保护作用。
1.材料
人头藤干粉（由湖南医药学院侗药研究中心提供）；尼莫地平片（购于亚宝药业集团股份有限公司，批号：国家准字H14022821）；超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（批号：A-001）、谷胱甘肽过氧化物歧化酶（GSH-Px）试剂盒（批号：Px-005）、丙二醛（MDA）测试盒（批号：A-003）、 红四氮唑（TTC）（批号：D-025）、考马斯亮兰（CCB）试剂盒（批号：A-045）均有南京建成生物工程研究所提供。
清洁级SD雄性大鼠，重量260-300g之间，由湖南省长沙市天勤生物技术有限公司动物中心提供，合格证号：SCXK(湘)20140011。
2.方法
2.1分组与给药方式
取SD雄性大鼠60只，随机分为假手术组、模型对照组、尼莫地平组(12mg/kg)、人头藤组(80mg/kg，参考丹参给药量及预实验结果)，每组12只。尼莫地平组每天分早晚两次灌胃，间隔12h，连续3天。人头藤组每天按8ml/kg腹腔注射给药，分早晚两次，间隔12h,连续3天。
2.2 模型的制备
制备模型前12h开始禁食，末次给药1h后开始制备大鼠右侧大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型。步骤：①用10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉；②仰卧位固定，备皮（剃毛）；③颈正中线旁开0.5cm切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜；④分离右侧颈总动脉（CCA）、颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)，在CCA远心端和近心段及ECA处挂线备用；⑤用微动脉夹暂时夹闭ICA，结扎CCA近心端和ECA，将CCA远心端打一单活结；⑥在距CCA分叉部4mm处用眼科剪剪一小口，将制好的栓线（栓线采用火烧法制作，在距栓线头18mm和20mm处分别做好标记）插入ICA，当栓线遇到轻微阻力时停止插线；⑦插线成功后，将CCA远心端栓线系紧；⑧缝合伤口；⑨栓塞2h后，拔出栓线，灌注2h、4h、6h、24h后断头取脑。假手术组动物仅进行右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉的分离，不插栓线。
2.3行为障碍评分
试验后2h参照Zea longa法对大鼠动物行为进行评分，采用5分制行为学评分标准给动物行为评分：行为正常为0分；右前爪不能完全伸展为1分；自发转圈或向右侧行进为2分；仅在受到刺激时行进为3分；对刺激无反应为4分。分数越高，动物行为障碍越严重，以评分在1-3之间的大鼠为实验对象。
2.4 抗氧化指标的测定
再灌注2h后,取左、右半脑，按质量与体积比1:9比例冰浴下（4℃）用生理盐水制备成10％的脑组织匀浆。用谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）试剂盒及丙二醛（MDA）试剂盒来测试实验后大鼠GSH-PX的活性及MDA的含量，取10%脑组织匀浆液稀释成1%的脑组织匀浆，用超氧化物歧化酶（SOD）测试盒测试实验后大鼠脑组织中SOD含量。
2.5 数据统计 数据统计采用 Graphad Prism 5软件系统处理，统计实验数据以x±s 表示，P<0.05为差异有统计学意义。
3.结果
3.1对MCAO实验大鼠神经行为障碍的影响
结果如表1所示，缺血2h后，MCAO各组老鼠行为障碍评分均为1-3分之间，空白对照组表现出相对明显的行为障碍；与空白对照组相比，人头藤可明显缓解大鼠神经行为障碍，人头藤组相对尼莫地平组可轻度缓解大鼠神经行为障碍；缺血4h后，人头藤组与尼莫地平组皆相对缺血2h后的行为障碍有所减轻，而人头藤组缓解行为障碍明显；缺血6h后，人头藤组与空白对照组皆表现出相对明显的行为障碍，人头藤组对缓解大鼠行为障碍相对尼莫地平组效果降低。
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3.2对MCAO实验大鼠脑组织中SOD、GSH-Px、MDA含量的影响
缺血2h后，与空白对照组和尼莫地平组相比，人头藤对大鼠脑组织中SOD、GSH-Px酶活性明显升高，MDA含量显著降低；缺血4h后，与空白对照组和尼莫地平组相比，人头藤对大鼠脑组织中SOD、GSH-Px酶活性升高，MDA含量降低；缺血6h后，与空白对照组相比，人头藤对大鼠脑组织中SOD、GSH-Px酶活性轻度升高，MDA含量轻度降低，人头藤组相对尼莫地平组对大鼠脑组织中SOD、GSH-Px酶活性轻度降低MDA含量轻度升高。结果见表2。
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与空白对照组相比，人头藤组2h稍许降低，4h明显升高，6h轻度降低；与尼莫地平组相比，2h稍许降低，4h明显降低，6h轻度升高
Fig3 MDA含量变化
4.讨论
大脑中动脉主要供应整个大脑半球的背外侧面，当大脑中动脉栓塞时，主要引起大脑皮质及纹状体的梗死，从而使大脑皮质额顶区和纹状体的背侧部分及感觉运动区受损[5]，主要表现为对侧上肢单瘫、偏盲及感觉障碍等行为，脑损伤程度通常通过脑梗死面积及行为障碍来评价。人头藤组在大鼠脑缺血再灌注2-4h后行为障碍学评分明显降低，在6h后，对改善行为障碍无明显作用，表明该药在缺血再灌注后2-4h内能改善MCAO大鼠的神经功能障碍。
随着近几年来对脑缺血再灌注损伤的研究，氧自由基的连锁反应在脑缺血再灌注损伤中占据着重要地位。缺血再灌注的过程中，活性氧（ROS）在线粒体生产过剩，迅速耗尽内源性抗氧化清除能力，从而使保护大脑组织细胞的氧化酶的SOD、GSH-Px酶含量降低，加剧细胞膜损伤的MDA酶含量升高，对细胞造成损害[6]。本研究发现，与空白对照组相比，人头藤组在脑缺血再灌注2h后，脑组织中SOD、GSH-Px酶含量显著升高，MDA含量轻度降低；4h后，脑组织中SOD、GSH-Px酶含量轻度升高，MDA含量明显降低；6h后，脑组织中SOD、GSH-Px酶含量轻度升高，MDA含量轻度降低。说明该药在脑缺血再灌注2h后可使体内氧自由基明显减少；4h后可明显减轻脑组织细胞的损伤；6h后的脑神经保护作用逐渐减低。表明侗药人头藤在脑缺血再灌注后具有一定的保护作用。韩威等[7]研究表明尼莫地平在大鼠急性脑缺血再灌注后，可显著减少大鼠脑缺血面积，同时能降低脑亚细胞中MDA、NO含量，升高SOD水平。尼莫地平片在2-4h的时间窗内对大鼠脑缺血再灌注后具有脑保护作用[8]。作用机制及其药理学作用机制尚未明确，有待进一步研究发现。
参考文献
[1]Sun J, Yao J Y, Huang S X, et al. Anti-oxidant activity of polyphenol and anthocyanin extracts from fruits of Kadsura coccinea (Lem.) [J]. Food Chem,2009, 117(2): 276-281.
[2]舒永志, 成亮, 杨培明等.黑老虎的化学成分及药理作用研究进展 [J].中草药, 2011, 42(4): 805-813.
[3]李贺然. 新型羊毛甾烷类化合物、其制备方法及抗癌用途 [P]. 中国专利: CN 101607886A, 2009-12-23.
[4]Yang J H, Zhang H Y, Wen J, et al. Dibenzocyclooctadiene lignans with antineurodegenera- tive potential from Kadsura ananosma[J]. J NatProd, 2011, 74: 1028-1035.
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[7]韩威, 野向春, 孟绍杰, 等. 尼莫地平对大鼠急性脑缺血再灌注损伤早期保护作用的研究[J].中风与神经疾病杂志, 2012,29(6):1003-2574.
[8]李淑婷,吉训明,罗玉敏.尼莫地平对脑缺血时间窗的影响[J].罕见疾病杂志,2009,16(2):15-18.