陈琦*1 金海洋#1 孟冰2 周权1 杨春生1 王丽萍1
1睢宁县人民医院骨科，江苏省徐州市睢宁县 221200；
2徐州医科大学生理学教研室，江苏省徐州市 221000
摘 要
目的 探讨富血小板血浆治疗骨缺损有效性。
方法 选择64只8月龄雄性新西兰大白兔开展实验研究。将兔分为富血小板血浆组(A组)以及空白对照组（B组），分析富血小板血浆治疗骨缺损有效性。在兔尺骨建立骨缺损模型。A组同种异体骨混合PKP凝胶植入实验兔尺骨骨缺损；B组单纯应用同种异体骨植入实验兔尺骨骨缺损。术后石膏外固定。12周后处死兔，拍摄X线片，Lane-Sandhu X-ray评分评价兔缺损尺骨愈合情况；同时组织学病理学检查，Lane-Sanduh 组织学评分标准评价植入骨断端骨痂生成情况。
结果 缺损尺骨植骨治疗12周以后，A组兔缺损骨组织愈合，B组兔尺骨骨缺损骨痂形成不明显。手术治疗12周以后，处死兔，对患肢拍摄X线片，观察缺损尺骨的骨痂填充情况，可以见到A组尺骨骨缺损骨痂填充情况良好。而B组兔尺骨骨缺损处骨痂形成不连续，缺损尺骨无明显新生骨填充。两组兔尺骨缺损新生骨痂填充情况Lane-Sandhu X-ray评分值配对t检验，差异有统计学意义，t=8.821， P=0.000<0.05。
植骨12个星期以后兔尺骨行组织病理学检查，A组苏木精-伊红染色 (Hematoxylin-Eosin staining,H-E )显示?新生骨骨痂和尺骨断端连续融合。B组组织切片H-E染色显示缺损尺骨组织为12周前植入的兔同种异体骨部分吸收，而新形成骨痂骨组织较少。比较两组尺骨骨缺损骨痂组织生成情况Lane-Sandhu 组织学评价得分配对t检验，t=11.198, P=0.000< 0.05. 差异有统计学意义。
结论 富血小板血浆联合同种异体骨填充治疗骨缺损，比单纯植入同种异体骨能更好地促进缺损骨组织新生骨痂形成。富血小板血浆具有促进新生骨痂形成填充骨缺损作用的巨大潜力，是缺损骨治疗的理想的选择。
关键词: 骨缺损; 骨折; 骨折愈合; 富血小板血浆
大于临界尺寸骨缺损是骨折不愈合、延迟愈合的重要因素 [1][2]。通过选择行之有效的治疗途径避免大段骨缺损不愈合，十分必要。富血小板血浆内含有诸多生长因子[3]，其能够有效加速骨细胞活化[4]，进而实现骨缺损修复以及骨诱导再生的效果。本文分析富血小板血浆联合同种异体骨填充治疗骨缺损情况，现将实验研究结果报告于下。
1资料与方法
1. 1 一般资料： 选择8月龄大健康新西兰大白兔 64只开展实验研究。A组兔体重为（4.970±0.811）kg，B组兔体重为（5.069±0.805）kg，将室温控制在 25℃ ，湿度为 52% 。
1. 2 选择和分组：实验分组情况为 实验组（A组， 富血小板血浆组) 以及 对照组( B组) 。以随机数字表法将实验兔分配于两组之中，每组32只。
1. 3 骨缺损模型建立，兔尺骨中段缺损造模（如图1），尺寸大于临界值[5]。A组骨缺损长度（2.1062±0.322）cm，B组骨缺损长度（2.307±0.301）cm.
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图1 尺骨缺损造模
1.4 兔同种异体骨制备
7月龄新西兰大白兔2只，处死；取骨；修剪松质骨颗粒；1%Dispase酶Ⅱ、0.1%Triton-X 100 脱细胞；37℃ 30%双氧水浸泡，脱蛋白；-70℃保存2周降低骨颗粒抗原性；高压蒸汽锅灭菌(137.3kPa, 30min)，灭菌。 4℃冰箱保存。
1.5 A组制备富血小板血浆和治疗措施
A组采髂骨血 3 ml 全面制备 PRP。 1: 10 添加凝血酶制成富血小板血浆凝胶，混合同种异体骨颗粒植入尺骨缺损。为避免术后饲养期间患肢再骨折等并发症[6]，缝合创区后应用石膏外固定患肢。
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图2、图3 完成手术、石膏外固定
1. 6 对照组B组单纯应用同种异体骨颗粒填充尺骨缺损，植骨、缝合、石膏外固定。
1.7 植骨治疗术后满12星期时处死兔，伤肢拍摄X 线片。根据Lane-Sanduh’s X-ray评分标准（如表1）进行兔尺骨缺损新生骨痂生成效果分析。
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1.8 植骨12周以后行尺骨缺损生成组织病理学检查，Lane-Sanduh 组织学评分标准（见表2）评价植入骨断端骨痂生成情况。
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1.9统计学处理 数据采用 IBM SPSS Statistics 20软件分析。采用对定量资料进行配对设计t检验，当 P ＜0. 05 时，说明两组数据差异具有统计学意义。
结 果
2.1 两组缺损尺骨组织愈合情况外相。
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图4 两组缺损尺骨组织愈合情况外相
注：*植骨治疗12周以后实验组缺损骨组织正在愈合（如图4A），
※对照组骨缺损明显（如图4B）
2.2 X线片观察两组尺骨缺损愈合情况（典型图像）
植骨术后满12周时处死兔，拍摄伤肢X线片，A组骨痂填充尺骨骨缺损，（如图5A）。而B组无明显新生骨骨痂形成，并有部分植骨骨颗粒吸收现象（如图5B）。
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图注:A组可见缺损尺骨骨痂填充并钙化（图5A）；而对照组无明显新生骨骨痂形成，并有部分植骨骨颗粒吸收现象（图5B）。
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注: 与B组相比，差异有统计学意义（P< 0.05）.
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2.3 两组尺骨缺损组织病理学检查。
植骨12个星期以后兔尺骨行组织病理学检查，A组苏木精-伊红染色 (Hematoxylin-Eosin staining,H-E )显示?新生骨骨痂和尺骨断端连续融合（如图7A、图7B）。B组组织切片H-E染色显示缺损尺骨组织为12周前植入的兔同种异体骨部分吸收，而新形成骨痂骨组织较少（如图7C、图7D）。比较两组尺骨骨缺损骨痂组织生成情况Lane-Sandhu 组织学评价得分配对t检验，t=11.198, P=0.000< 0.05. 差异有统计学意义。
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图7 植骨12周以后，植入骨与骨缺损断端连接处骨组织切片（H-E染色）
图注：实验组（A组）植入骨与骨缺损断端的连接处有软骨化骨向骨组织过度的状态，可见软骨骨化组织与骨组织(图7A，×100倍)，正常骨组织(图7B，×200倍) ；B组切片显示新生成骨组织较少，显微镜下显示为H-E蓝染的含钙较多的“松质骨支架”(图7C，×200倍；图7D，×400倍) 。
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图8 两组骨缺损愈合情况Lane-Sandhu′s 组织学评分
注: 与B组相比，差异有统计学意义（P< 0.05）.
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3.讨 论
大于临界值骨缺损自然愈合过程中容易出现伤骨延迟愈合、不愈合等情况。在 PRP 内含有大量的生长因子。实验证明[7][8 ][9 ]，富血小板血浆显著表达 血清骨钙素骨钙蛋白（BGP）、血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β1（TGF-β1）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）和血小板衍生生长因子B（PDGF-B）。BMP-2和PDGF-B显着上调，而AKP表达下调。修复局部血管，促进成骨细胞相关因子和血管生成相关因子的表达，对骨缺损的修复具有较高的效果。其中转化生长因子( TGF-β) 在 75pg/ ml 水平时，PRP对于诱导干细胞增殖分化效应最为显著[10]。能够促进成骨细胞增殖、分化，同时抑制了破骨细胞生成以及骨吸收[11]。进而实现对创伤愈合以及骨组织再生促进效用。
本实验富血小板血浆凝胶所含血小板浓度较生理性血小板血浆浓度高。在实验中有放大血小板生理学效应的作用。本实验是PRP应用于生物治疗的理想模型。研究重点是通过放大的PRP的治疗作用，证实PRP具有治疗骨缺损的潜能。PRP凝胶将生理状态下的流动状态，转化为容易操作的半固态。某种程度上，和实际情况也有一定区别。理想状态下干预了骨缺损修复的自然进程。为PRP应用于骨缺损治疗提供理想化模型。
4 结论
富血小板血浆联合同种异体骨填充治疗骨缺损，比单纯植入同种异体骨能更好地促进缺损骨组织新生骨痂形成。富血小板血浆具有促进新生骨痂形成填充骨缺损作用的巨大潜力，是缺损骨治疗的理想的选择。
参考文献
[1]Lv ZY, Chen X M, Zhang YJ. Critical-Size Defects of Animal Models for Bone Regeneration[J]. Journal of biomaterials and tissue engineering,2018,8(6):761-770.
[2]Toogood, Paul MD;Miclau, Theodore MD.Critical-Sized Bone Defects: Sequence and Planning.[J]. Journal of Orthopaedic Trauma,2017,31(5):23-26.
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[11]Daniel S, Nele H, Ralph P, et al.Positive impact of Platelet-rich plasma and Platelet-rich fibrin on viability, migration and proliferation of osteoblasts and fibroblasts treated with zoledronic acid.[J].Scientific reports.2019,(1):8310.
第一作者： 陈琦，男，1987年生，江苏省徐州市人，汉族，2016年遵义医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事骨组织损伤修复与干细胞临床应用方向研究。
通讯作者：金海洋，男，副主任医师，江苏省睢宁县，221200。
基金资助：睢宁县科技创新专项资金（SN201818）；
睢宁县人民医院院级科研项目(snxrmyy202002)。