毛晶1 方传丰2 李慧3 张鹏霞1 通讯作者：朴金花1
1佳木斯大学基础医学院 154000; 2哈尔滨医科大学附属第四医院 150001; 3佳木斯大学附属第一医院 154007
[摘要] 目的 探讨金属基质蛋白酶MMP-2、MMP-9及其抑制因子TIMP-2、TIMP-1在非黑色素性皮肤癌中的表达。 方法 取皮肤癌手术切除标本40份，进行免疫组化检测MMP-2、MMP-9及其抑制因子TIMP-2、TIMP-1的表达。 结果 MMP-2、MMP-9在非黑色素皮肤癌中的表达的阳性率、染色强度、表达强度均显著高于正常皮肤。TIMP-2、TIMP-1在非黑色素皮肤癌中的表达的阳性率、染色强度、表达强度均显著低于正常皮肤。 结论 基质金属蛋白酶（MMP）在非黑色素性皮肤癌中呈高表达，基质金属蛋白酶组织抑制因子呈低表达，两者比例失衡与皮肤癌的浸润和转移有关。
[关键词] 皮肤癌；MMP-2；MMP-9；TIMP-2；TIMP-1
[Abstract] Objective To investigate the expression of MMP-2, MMP-9 and TIMP-2, TIMP-1 in non melanoma skin cancer. Methods the expressions of MMP-2, MMP-9, TIMP-2 and TIMP-1 were detected by immunohistochemistry. Results the positive rate, staining intensity and expression intensity of MMP-2 and MMP-9 in non melanoma skin cancer were significantly higher than those in normal skin. The positive rate, staining intensity and expression intensity of TIMP-2 and TIMP-1 in non melanoma skin cancer were significantly lower than those in normal skin. Conclusion high expression of matrix metalloproteinase (MMP) and low expression of tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP) in non melanoma skin cancer. The imbalance of matrix metalloproteinase and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase is related to the invasion and metastasis of skin cancer.
[Key words] skin cancer; MMP-2; MMP-9; TIMP-2; TIMP-1
非黑色素性皮肤癌主要包括基底细胞癌（BCC）和鳞状细胞癌（SCC），是临床常见的皮肤癌，约占所有皮肤癌的90%。在美国，每年患非黑色素皮肤癌的人口约100万，其中基底细胞癌占70%-80%，鳞状细胞癌约占20%。随着我国人口平均寿命的延长，皮肤癌发病率也在逐渐升高。在我国以鳞状细胞癌为主。肿瘤的侵袭和转移是预后不良的主要原因。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥重要的作用，而基质金属蛋白酶水解酶组织抑制因子可抑制基质金属蛋白酶的活性[1]。有大量的研究证实，MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1在多种恶性肿瘤中有表达。本文主要探讨其在非黑色素皮肤癌中的表达。
1 材料与方法
1.1 研究材料
选择2010～2012年在我院手术切除治疗的非黑色素皮肤癌患者40例。其中鳞状细胞癌（SCC）25例，为SCC组，男14例，女11例，年龄35～68岁，平均（56.7±21.3）岁。其中头颈部10例，外生殖器7例，四肢5例，躯干3例；高分化18例，中分化7例。基底细胞癌（BCC）15例，男9例，女6例，年龄37～70岁，平均（57.9±19.8）岁。其中头颈部7例，外生殖器4例，四肢3例，躯干1例。另选择20例整形患者为对照组，男12例，女8例，平均年龄（50.7±22.8）岁。所有入选对象均无结缔组织病、免疫系统疾病及其他系统严重疾病。术前未进行其他抗肿瘤治疗。三组患者一般资料比较差异无统计学意义，具有可比性。
1.2 检测方法
所有皮肤癌患者均经手术切除病变组织送检。取病变组织10%甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，厚度4 μm，各切5张，1张行HE染色，余4张行免疫组化染色。切片60℃烘焙2 h，脱蜡，就行梯度水化。蒸馏水冲洗2次，加3%H2O2溶液孵育10 min；蒸馏水冲洗，PBS缓冲液冲洗。血清封闭，分别加一抗，温育1h后，取出，4℃过夜。PBS缓冲液冲洗，每次5 min，共3次。加二抗，37℃，放置30 min。PBS液冲洗，每次5 min，共3次；加三抗，37℃、30 min，PBS液冲洗，每次5 min，共3次。加显色液，控制显色时间，然后自来水洗涤3次，终止显色。蒸馏水冲洗，苏木素复染，盐酸分化，蒸馏水再次冲洗。酒精梯度脱水，二甲苯透明，封片。
1.3 结果判定方法[2]
细胞浆或细胞膜染成棕黄色为阳性细胞。观察10个高倍镜。阴性：无瘤细胞；阳性瘤细胞<1/3，着色浅，为（+）；阳性瘤细胞1/3-2/3，着色较深为（++）；阳性瘤细胞>2/3，着色深为（+++）。表达强度采用自动分析系统测量肿瘤细胞阳性成分的平均吸光度。根据免疫组化的检测结果，统计MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1阳性率与染色强度和表达强度，比较三组之间的差异。
1.4 统计学处理
采用SPSS12.0统计学软件进行数据处理，三组间计数资料采用行×列卡方检验，计量资料采用均数±标准差表示，多组间的比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MMP-2的表达
MMP-2主要表达于细胞浆，在非黑色素皮肤癌中的表达呈片状、弥散分布；在非黑色素皮肤癌中的表达高于正常皮肤表达。
2.2 MMP-9的表达
MMP-9在非黑色素皮肤癌中的表达的阳性率、染色强度、表达强度均显著高于正常皮肤。
2.3 TIMP-2的表达
TIMP-2在非黑色素皮肤癌中的表达的阳性率、染色强度、表达强度均显著低于正常皮肤。
2.4 TIMP-1的表达
TIMP-1在非黑色素皮肤癌中的表达的阳性率、染色强度、表达强度均显著低于正常皮肤。
3 讨论
皮肤癌在我国的发病率较低，上海市肿瘤研究所1988年的上海市市区恶性肿瘤发病率统计资料表明，非黑色素皮肤癌的发病率为1.53/10万，但随着人们生活习惯及环境的变化，皮肤癌的发病率也在逐年升高。非黑色素皮肤癌中主要是鳞状细胞癌和基底细胞癌。鳞状细胞癌往往由角化病、黏膜白斑及其他癌前疾病转化而成，生长较快，早期即形成溃疡。基底细胞癌起病时常无症状，初期多为基底较硬斑块状丘疹，有的呈疣状隆起，而后破溃为溃疡灶改变，不规则，边缘隆起，似火山口，底部凹凸不平，生长缓慢。SCC发病原因与多个基因突变损坏有关。基底膜的完整性受到破坏与肿瘤的浸润、转移、复发有重要关系。
MMP是水解细胞外基质的蛋白裂解酶，包括基质中以及整合于质膜中的各种胶原酶和弹性蛋白酶等。MMP是一个大家族，因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名，其家族成员具有相似的结构，一般有疏水信号肽序列、前肽区、催化活性区、富含脯氨酸的铰链区、羧基末端区，与酶的功能有关。其中酶催化活性区和前肽区具有高度保守性。MMPs成员上述结构的基础上各有特点。各种MMP间具有一定的底物特异性，但不是绝对的。同一种MMP可降解多种细胞外基质成分，而某一种细胞外基质成分又可被多种MMP降解，但不同酶的降解效率可不同。
MMPs几乎能降解ECM中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，从而在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视，被认为是该过程中主要的蛋白水解酶。目前MMPs家族已分离鉴别出26个成员，编号分别为MMP1～26。根据作用底物以及片段同源性，将MMPs分为6类，为胶原酶、明胶酶、基质降解素、基质溶解素、furin活化的MMP和其他分泌型MMP。MMP-2基因位于人类染色体16q21，由13个外显子和12个内含子所组成，结构基因总长度为27kb，与其他金属蛋白酶不同，MMP-2基因5’旁侧序列促进子区域含有2个GC盒而不是TATA盒。活化的MMP-2定位于细胞穿透基质的突出部位，估计其在酶解细胞间基质成分及基底膜的主要成分Ⅳ型胶原中有“钻头”的作用。
MMP-9是糖化的Ⅳ型胶原酶。任立新[3]研究认为MMP-9在胃癌细胞SGC7901中的高表达与其细胞的转移能力密切相关。王阿曼等[4]研究显示，MMP-2为小细胞肺癌预后不良指标，MMP-2 F可以协同促进肿瘤的新生血管形成和细胞增殖。石帅等[5]研究结果显示，MMP-2和MMP-9在非小细胞肺癌中表达阳性率较高，在癌症细胞浸润和转移阶段有促进作用，对恶性肺癌的诊断具有重要意义。付玉环等[6]对乳腺癌中MMP-2和MMP-9表达及其与血管密度的关系进行研究，MMP-2和MMP-9可促进乳腺癌组织中微血管的生成，并参与乳腺癌的浸润和转移。
基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMPs）是基质金属蛋白酶（MMPs）的天然抑制物，可以与MMP不可逆性结合，抑制其作用，从而防止肿瘤的转移、浸润。MMP组织抑制因子广泛存在于组织及体液中，主要由巨噬细胞和结缔组织产生。MMP组织抑制因子和MMP的表达平衡主要与ECM的降解程度有关，这也与肿瘤的浸润转移有关。在肿瘤组织中，MMP组织抑制因子表达下降，从而对MMP的抑制作用下降，导致MMP过表达，促进肿瘤的发生、浸润和转移。TIMP-1能抑制大多数MMP，但以抑制MMP-9为主，TIMP-2也能抑制大多数的MMPs，以抑制MMP-2为主。雒洪志等[7]对结肠癌组织中的MMP-9和TIMP-1进行研究，MMP-9 mRNA表达与结肠癌Dukes分期、淋巴结转移及分化程度相关，TIMP-1蛋白在结肠癌和癌旁组织中表达均较MMP-9蛋白表达弱，MMP-9表达在结肠癌的进展中具有促进作用，而TIMP-1表达则可能具有拮抗作用。陈其军等[8]对胃癌中MMP-9和TIMP-1表达失衡进行研究，结果提示MMP-9/TIMP-1表达失衡与ZHX2表达相关。
本研究结果提示，在非黑色素皮肤癌中MMP-2和MMP-9的阳性率、染色强度及表达强度均显著高于正常皮肤组织中，而TIMP-2、TIMP-1则显著低于正常皮肤组织中。说明MMP-2和MMP-9与皮肤癌的发生、发展有关，而TIMP-2、TIMP-1表达下调与肿瘤的浸润和发展也有关系，TIMP-2、TIMP-1和MMP-2、MMP-9比例的失调在肿瘤的浸润和发展中具有重要的作用。
综上所述，MMP在非黑色素性皮肤癌中呈高表达，MMP组织抑制因子呈低表达，两者比例失衡与皮肤癌的浸润和转移有关。
[参考文献]
[1] Joyce E. Matrix metalloproteinases，angiogenesis，and cancer[J]. Clin Cancer Res，2003，9：551.
[2] 王平，杨金凤，张庆，等. 基质金属蛋白酶-9基因在胃癌及癌旁组织中的表达及意义[J]. 中国基层医药，2007，14（4）：559-561.
[3] 任立新. MMP-9在胃癌细胞中的表达及意义[J]. 中国社区医师：医学专业，2012，14（30）：234.
[4] 王阿曼，蔡欣，周涛，等. MMP-2、VEGF、CD105和Ki-67在小细胞肺癌中的表达及预后相关性研究[J]. 临床肿瘤学杂志，2012，17（11）：988-993.
[5] 石帅，罗于海，文光瑞. 非小细胞肺癌组织中MMP-2和MMP-9的表达和意义[J]. 中国现代医学杂志，2012，22（24）：49-51.
[6] 付玉环，张自忠，徐泊文，等. 乳腺癌中HSG和MMP-2/MMP-9与MVD的关系[J]. 中国妇幼保健，2012，27（33）：5385-5388.
[7] 雒洪志，黄宗海，余元龙，等. MMP-9和TIMP-1在结肠癌组织中的表达及其临床意义[J]. 临床肿瘤学杂志，2012，17（8）：712-716.
[8] 陈其军，吕自力，党裔武，等. MMP-9和TIMP-1在胃癌组织中的表达失衡及其与ZHX2的相关性[J]. 世界华人消化杂志，2012，20（20）：1832-1837.