党迷 徐斌 渠冬菊
克拉玛依市独山子人民医院， 新疆 克拉玛依833699
摘要：目的了解健康体检者体内Septin9基因甲基化水平，做好高危人群Septin9基因甲基化检测，达到结直肠癌的早期筛查目的，提高本地区结直肠癌的综合防治水平。方法选自2018年2月至2020年8月我院体检中心健康体检者221例，分析Septin9基因甲基化检测结果。结果发现健康体检者Septin9基因甲基化阳性率为4.9%（11/221）与文献报道一直。结论在高危人群中推广Septin9基因甲基化检测，提高结直肠癌的早期筛查率，是提高结直肠癌早诊早治、降低结直肠癌死亡率的有效途径。
关键词：Septin9基因甲基化；结直肠癌；早期筛查
在中国结直肠癌的发病率与死亡率逐年上升，结直肠癌的发生、发展是一个多因素影响、多基因参与并需经历多阶段演变的复杂过程，肠癌发展进程由增生、小腺瘤、大腺瘤、重度非典型增生、早期腺癌、晚期腺癌等阶段，大约需要5-10年的疾病发展期，临床症状出现时间晚，国民早期筛查意识差，无症状不检查，往往错过最佳治疗期。目前结直肠癌体外筛查的方法有CEA、粪潜血和肠镜检查。CEA、粪潜血灵敏度较低，肠镜筛查虽然是临床筛查肠癌的金标准，但流程复杂、创伤大、风险高、左右结肠有差异、恐惧意识、人为误差，加之肠镜诊断的准确性和治疗的安全性很大程度上取决于肠道准备的质量等，使肠镜的受检率低于3%，不适合早期筛查。我院自2018年1月引进Septin9基因甲基化技术并在结直肠癌早期筛查及高风险患者推广应用，现总结如下：
1.患者一般资料：
选自我院2018年1月至2020年9月在体检中心健康体检者221例，年龄在31-66岁之间，男性平均年龄49岁，女性平均年龄48岁。
2.标本采集与制备：
标本采集与处理：采用EDTA-K2抗凝负压采血管采集外周静脉血10m L, 在采血4 h内进行2次1350×g离心12 min, 完成血浆分离, 吸取3.5 m L血浆样本置-20℃保存, 实验在4周内完成检测。
3.检测方法：3.5ml血浆+3.5ml 裂解液，涡旋混匀，RT静置10min；加入90ul混匀磁珠、2.5ml无水乙醇，颠倒混匀5-6次，10-20rpm旋转混匀40-50min；取下15ml离心管，置于磁力吸附架；弃上清，加入1.5ml洗液A，涡旋重悬磁珠，转移到2.0ml离心管，置于磁力吸附架上，吸附磁珠，弃上清；短暂离心，再次吸弃上清；加入100ul洗脱液，涡旋混匀，80℃ 1000rpm震荡10min；短暂离心，置于磁力吸附架，收集洗脱液至新的2.0ml离心管（4℃可保存24h，不可冷冻）；加入150ul亚硫酸盐溶液、25ul保护液，涡旋混匀，80℃ 静置孵育40-50min；降温震荡仪至23℃；离心管中加入1000ul洗液A，20ul磁珠，涡旋混匀，23℃1000rpm震荡40-50min；短暂离心，置于磁力吸附架，弃上清；加入800ul洗液A，涡旋洗涤磁珠，离心吸附弃上清；加入800ul洗液B，涡旋洗涤磁珠，离心吸附弃上清；加入400ul洗液B，涡旋洗涤磁珠，离心吸附弃上清；再次离心吸附弃上清x2；室温干燥10min；加入60ul洗脱液，涡旋混匀，23℃1000rpm震荡10 min；短暂离心，吸附。最后PCR反应液的配置：每个反应配置32ulPCR反应液+1.6ulTaq酶[1]。
4.结果：统计221例Septin9基因甲基化检测结果，阳性11例，阳性率4.9%（11/221），与文献报道一致。
5.结论：结直肠癌 (colorectal cancer, CRC) 发病率高, 致死性强, 严重威胁人类健康。Septin9基因与CRC发生密切相关, 其在癌组织中呈高度甲基化, 是CRC的重要分子特征。检测Septin9基因在患者血浆中的甲基化水平对CRC筛查具有较为理想的效果。从我院Septin9基因甲基化检测结果看，对于年龄大、惧怕做肠镜、肠镜有禁忌者的高风险人群，首先进行Septin9基因甲基化检测，Septin9基因甲基化阳性者进一步做肠镜检查。
大肠癌在早期，通常没有明显症状，许多患者确诊时，已经是中晚期，治疗的最佳时机已经错过，各种治疗方法都收效甚微。而如果在早期（原位癌期和I期）检测到大肠癌，五年生存率可达到90%以上。但目前我国结直肠癌的早期诊断率较低，明显低于欧美国家。给患者在感情和经济都带来了巨大的负担。所以逐步普及结直肠癌筛查和推广早诊早治，是提高我国结直肠癌早期诊断率、降低结直肠癌相关死亡率的有效途径[2]。
Septin9基因甲基化检测技术是FDA批准的一个大肠癌血液筛查项目，首次进入国家临床诊治权威指南，用于大肠癌早期筛查，是一种无创、无痛、采样方便的非侵入性基因检测技术，患者依从性高，检测灵敏度76.63%，特异性95.93%[2]。目前只有甲基化是最成熟、最稳定、检测方法能够应用在临床上的机制，甲基化的Septin9基因被公认为是结直肠癌早期发生发展中特异性的分子标记物。我院自2018年1月引进该技术并在结直肠癌早期筛查、疗效监测和术后评估、高风险患者推广应用，高风险人群包括（1）个人消化系统疾病史/家族癌症史人群；（2）有结直肠癌治疗中患者及术后疗效检测者；（3）结直肠镜禁忌者或拒绝做肠镜检查者；（4）有排便习惯改变、大便性状改变的人群；（5）环境不良、有饮食及其它不良嗜好。Septin9甲基化阳性患者随访时告知要做肠镜复查，进一步提升我院结直肠镜的受检率，随访时给患者做健康宣教，调整合理的膳食结构，适量体育运动等，为患者做健康指导，有效提升我区结直肠癌的综合防治水平，项目契合民生健康迫切需求，节约医疗资源，填补疆内空白。
在结直肠癌的发生和发展过程中, SEPT9 基因DNA甲基化可导致SEPT9 基因的m RNA和蛋白表达降低, 从而导致CRC发生的关键调控机制发生改变，而且通过DNA去甲基化试剂作用于结肠癌细胞后发现SEPT9-m RNA和蛋白表达增加, 提示SEPT9 或许可以作为一个基因治疗的靶点 [3]。现代医学已经进入了基因检测和靶向治疗、免疫治疗的时代，其中Septin9基因甲基化血液检测，可用于大肠癌早期筛查方案，应该逐渐被大家所了解和接受。
6.参考文献：
[1] Septin9基因甲基化检测试剂盒(PCR荧光探针法)说明书.
[2]郭婉，汪钰翔，丁先锋.Septin9基因及甲基化检测在结直肠癌中的研究进展，临床检验杂志[J]．2018,36（2）:133-134.
[3] 徐峰，王娟.结直肠癌患者SEPT9基因甲基化检测的研究进展，继续医学教育.2016，30（06）134-136.