杨世娟
连云港康乐药业有限公司，江苏连云港 222100
摘要：本文采用高效液相色谱法（HPLC）测定了对乙酰氨基酚片中有关物质的含量。结果表明，采用HPLC法测定对乙酰氨基酚片中的主要药物:对乙酰氨基酚、6种已知杂质（对氯苯乙酰胺、对氨基酚和a、N-苯乙酰胺、对丙乙酰胺、对硝基酚）以及3种特殊辅料（羟苯乙酯、羟苯甲酯和杂质），羟苯丙酯和1种未知杂质的分离度均大于1.5。高效液相色谱法准确度高，专属性强，可用于对乙酰氨基酚片中有关物质的测定。
关键词：HPLC法；对乙酰氨基酚片；物质；含量
0.引言
对乙酰氨基酚片是乙酰苯胺类解热镇痛药，主要用于缓解轻中度疼痛，可以将膝盖疼痛减轻到最小程度。是治疗轻度骨关节炎的首选短期镇痛药。对乙酰氨基酚片作为常用的解热镇痛药，在治疗剂量范围内是安全可靠的。但剂量过大，可能导致急性肝功能衰竭，也可能引起血压升高、哮喘、肝毒性、胃肠道反应等不良反应。因此，应严格遵循对乙酰氨基酚片的使用原则。《国家药品安全十二五规划》中明确指出对乙酰氨基酚片是一种一致性评价品种。参考处方资料，原研药由对乙酰氨基酚、预胶化淀粉、二氧化硅、海藻酸、聚维酮K30、羟苯甲酯、羟苯乙酯和羟苯丙酯组成。这是一种有标记的胶囊片剂。产品中可能存在的主要杂质是对氨基苯酚、对氯苯乙酰胺和杂质a、b、d和f。这些杂质中大多数含有潜在的遗传毒性。然而，除了对氨基苯酚外，2015年版《中国药典公约》（第二部分）并未控制上述其他杂质。此外，为了避免生产经营中频繁清洗设备造成的污染，在处方中加入了羟苯甲酯、羟苯乙酯和羟苯丙酯，所有这些都可以在分析中检测到。以上三种成分作为制剂的具体辅料，在计算杂质含量时应扣除。鉴于本公司无相关物质检测项目，而文献报道的方法不能完全将已知杂质和未知杂质从主要成分中分离出来，本研究建立了对乙酰氨基酚片的测定方法，以便同时分离片剂中已知杂质、未知杂质、主成分和特定辅料，为对乙酰氨基酚片一致性评价中产品质量保证和杂质研究提供方法支持。
1.材料
1.1 仪器
Lc-2030高效液相色谱仪，包括在线除气器、二元高压泵、自动进样器、二极管阵列检测器（日本岛津公司）、ms205du电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）和昆山市超声仪器有限公司的kq5200b超声波清洗机。
1.2 药品与试剂
对乙酰氨基酚片（国泰康宁制药有限责任公司，重庆，批号：180501，180502，180503，规格：0.5g）。对乙酰氨基酚，对照品（批号：100018－201610，纯度：99.9%），对氨基酚（批号：100802-201203，纯度：100%），对氯苯乙酰胺参考（批号：100850201803）杂质a（批号：36404，纯度：99.8%），杂质对丙酰氨基酚（批号：43849，纯度：99.9%），杂质N-苯乙酰胺对照品（批号：76103，纯度：100%），杂质对硝基酚（批号：66550，纯度：99.9%购自英国、冰醋酸的LGC公司，其他试剂分析纯，水为超纯水。
2.方法与结果
2.1溶液的制备
对乙酰氨基酚，p-氯苯乙酰胺通过精确称重和甲醇溶解制备含有1mg/ml氨基苯酚、2.5g/ml对氯苄基乙酰胺和800g/ml杂质a、对丙酰氨基酚、N-苯乙酰胺对丙乙酰胺、对硝基酚的混合溶液，制备杂质对照溶液。将5ml上述对照储备液用甲醇稀释至50ml，作为杂质对照溶液。
2.2色谱条件
色谱柱为安捷伦5hc-c8（250mm，4.6mm，5m）。流动相a：冰醋酸甲醇水，流动相B:冰醋酸甲醇水，梯度洗脱。流速：0.9ml/min，柱温：40。检测波长：254nm。进样量：5μL。
2.3破坏试验
取对乙酰氨基酚片（批号：180501），研磨成细粉，精密称定，放置在25ml容量瓶中，加入5ml甲醇放入离心机（功率：300W，频率：40KHz）5min，然后放入高温（95℃水浴8h）、酸（加入4mL 1mol/L盐酸溶液，室温放置21h）、碱（加1mol/L氢氧化钠）5min，取出溶液，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度（先用碱或酸调pH至中性），过滤滤液，按“2．2”键，记录色谱图并与供试品溶液进行比较，作为未损坏的溶液。结果表明，在上述破坏条件下，主成分可以从已知杂质和未知杂质中分离出来，说明上述条件对主成分和杂质的测定没有影响。
2.4稳定性试验
取对乙酰氨基酚片，研磨，取适量细粉，准确称定，置于25ml量瓶中，用甲醇溶解稀释，制成含20g/ml对乙酰氨基酚的溶液。过滤后，取适量滤液作为供试品溶液（批号：180501）分别置于室温和冰箱（温度1-4）中。分别于0、2、4、6、8、12h取样，按色谱条件进样。记录峰面积，根据精密度测试方法计算各杂质含量。杂质B的RSD为1.73%（n=6），未知杂质的RSD为0.75%（n=6）。在每个时间点没有检测到其他已知杂质，但溶液的颜色从无色变为黄色。供试品溶液置于冰箱中，12小时内峰面积已知杂质和未知杂质无明显变化，RSD小于2%（n=6），表明供试品溶液在贮藏1-4小时后12h内稳定。
2.5样品中有关物质的测定
取3批样品配制供试品溶液，按色谱条件进样，记录峰面积，计算杂质含量
根据精密度试验的重复性方法。结果见表1。
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由表1可知，对乙酰氨基酚片三批产品均检出对氨基苯酚、杂质b和未知杂质，未检出对氯苯和对乙酰胺杂质a、对丙酰氨基酚、N-苯乙酰胺对丙乙酰胺、对硝基酚。
3.结束语
对乙酰氨基酚片和对氯苯乙酰胺结构中的杂质a和d含有苯乙酰胺结构片段，杂质b含有苯丙酰胺结构片段，杂质f含有硝基苯结构片段，对氨基苯酚含有苯胺结构片段，均具有潜在的遗传毒性。因此，有必要对这些杂质的含量进行检测和控制，以保证产品的安全。但在2015年版《中国药典》（第二部分）中，除了对乙酰氨基酚片中氨基酚的含量外，其他杂质的含量没有规定，不能保证产品的安全。本研究可以弥补其不足。通过破坏性试验可以看出，在该色谱条件下，杂质a、对丙酰氨基酚、N-苯乙酰胺对丙乙酰胺、对硝基酚、氨基酚、氯苯乙酰胺等也能有效检出，即原料合成过程中可能产生的其他杂质（由ep9.4对乙酰氨基酚公司按质量标准，杂质c、e、h、l、m、n等等）也可以有效地检测到。
综上所述，本研究建立的方法简便易行，灵敏度高，准确度好，稳定性好，重复性好，经久耐用。所有已知杂质和未知杂质都能有效地从主要成分和特定的辅助材料中分离出来，可用于对乙酰氨基酚片的质量控制，以保证产品的安全、有效和质量控制。
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