曾德二 吴娟 郑彦坤
安庆师范大学 安徽安庆 246133
摘要： RNAi技术是研究基因功能的常用方法。本研究从水稻幼苗叶片中提取RNA，通过反转录生成cDNA。根据NCBI数据库公布的水稻OsRHP1基因设计引物，通过中间载体pSK int 不同的酶切位点，获得反向重复序列的干扰片段。以pHB为过表达载体，将干扰片段和过表达载体通过双酶切连接最终得到RNAi干扰载体。通过双酶切和琼脂糖凝胶电泳对重组的质粒进行鉴定从而判断水稻的OsRHP1 RNAi载体是否构建成功，为进一步研究该基因的功能奠定基础。
关键词: 水稻，OsRHP1基因，RNAi，载体构建
Construction of RNAi interference vector of rice OsRHP1 gene
Zeng de’er, Wu juan, Zheng yankun
Anqing normal universty, Anqing,246133
Abstract：RNAi is a common method to study gene function. In this study, RNA was extracted from the leaves of rice seedlings, and cDNA was produced by reverse transcription. Primers were designed according to the rice osrhp1 gene published in NCBI database. The interference fragment of reverse repeat sequence was obtained by digesting different sites of PSK int. Using PHB as overexpression vector, RNAi interference vector was obtained by double enzyme digestion. The recombinant plasmid was identified by double enzyme digestion and agarose gel electrophoresis to determine whether the OsRHP1 RNAi vector of rice was successfully constructed, so as to lay a foundation for further studying the function of the gene.
Key word：rice，Oryza sativa，OsRHP1，RNAi, vector construction[]
1 引言
RNAi干扰是指双链RNA分子诱导的内源mRNA序列特异性降解的沉默现象。RNAi具有不改变基因组遗传组成、能够稳定高效的降解和沉默单基因、多基因的特点。近年来已经发展成为研究基因功能的一种普遍技术。本研究为了研究水稻中一种新的RING (really interesting new gene) finger结构域的锌指蛋白基因，拟采用RNAi干扰技术来构建载体转化水稻，从而为研究水稻RING finger 基因的功能提供依据。本研究中构建水稻OsRHP1 RNAi载体的方法采用传统的酶切-连接为基础的构建方法。通过设计多个酶切位点的引物和多次克隆，获得目的片段的反向重复序列干扰片段，最后通过酶切片段和过表达载体的连接完成RNAi干扰载体的构建。
2 材料和方法
2.1 实验材料、试剂与引物
水稻(Oryza sativa subs.japonica)日本晴种子、大肠杆菌受体菌株DH5α、农杆菌菌株为EHA105、质粒连接载体pEASY-blunt、过表达构建载体pHB均为四川大学刘永胜老师实验室惠赠。RNA 提取试剂Trizol购自Invitrogen公司、限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、PrimeStar热启动高保真DNA聚合酶等购自大连宝生物工程公司。质粒提取及DNA回收试剂盒均购于北京天根生物科技有限公司。PCR引物的合成和测序由华大基因完成。
2.2 主要仪器
超净工作台（苏州，中国）
BioRed低温超速离心机（BioRed公司产品）
icematic N35s制冰机
微量移液器（BioRed公司产品）
PCR仪（BioRed公司产品）
恒温培养箱
2.3 方法
水稻OsRHP1 基因的RNAi载体构建引物如下：
Os08gRNAi-f1: GTCGAC GAGCTC ACCATCTCCCGTGTCCTCCT
Os08gRNAi-r1: AAGCTT CAGCTGGTCGTCGCCGTCCT
Os08gRNAi-f2: GGATCC ACCATCTCCCGTGTCCTCCT
Os08gRNAi-r2: CCCGGG CAGCTGGTCGTCGCCGTCCT
反应条件为94℃ 4 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 35s (30 cycles)；72℃ 5 min。由于Psk int载体中左边多克隆位点不含有SacI酶切位点，而最后的构建到pHB载体上只能用BamHI和SacI两个位点，因此因此在设计RNAi第一对引物时在SalI的后面添加了一个SacI酶切位点，方便最后BamHI和SacI双酶切回收片段连pHB载体。高保真PCR产物I经电泳回收后用SalI和HindIII双酶切，然后与用相同限制酶酶切的中间载体pSK-int连接，产物为pSK-int 1；高保真PCR产物II经电泳回收后用BamHI和SmaI双酶切，然后与用相同限制酶酶切的pSK-int 1连接，产物为pSK-int 2；再用SacI和BamHI双酶切pSK-int 2，回收其小片段（即含有反向插入的PCR产物I和II以及pSK-int本身所带的intron的片段），然后与用BamHI和XbaI双酶切的pHB载体连接。最终的RNAi载体命名为pHB-Os08gRNAi。其流程如下图所示：
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3 结果与分析
构建好的RNAi质粒载体通过潮霉素抗性基因的PCR检测，证明RNAi载体构建的成功。结果如凝胶电泳图1所示：
4讨论
RNAi干扰技术已经成为分子生物学研究领域的高效手段，广泛应用于植物的功能基因研究。通过人为设计双链RNA片段，进而通过转基因的沉默把内源相同序列的mRNA降解，从而阻止相关目标基因的表达。双链RNA序列的大小对RNAi的抑制效果有重要的影响。一般来说干扰片段在300-500bp之间的干扰效果较好，太长或者太短都不利于干扰片段在细胞内的沉默效应。本研究通过两对不同酶切位点的反向重复引物，分别克隆得到两个小干扰片段，最后通过酶切作用和过表达载体连接，能够在体内得到稳定的双链发夹结构的RNA 干扰片段，从而为后续的水稻OsRHP1基因的功能研究提供了实验依据和材料。
参考文献
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作者简介：曾德二（1980.06-），男，汉，湖北咸宁，讲师，博士研究生，研究方向：基因的分子生物学
通讯作者：曾德二，博士，研究方向：基因的分子生物学
安徽省自然科学基金项目“水稻新的RING finger 因子OsRHP1的抗旱机理研究（1908085MC81），安徽高校自然科学研究项目“有色稻籽粒颜色遗传分析与功能性分子标记的设计”（KJ2018A0356）