张兰兰 张永萍 王燕*
（陕西国际商贸学院医药学院，陕西咸阳 712046）
摘要 本研究以一定浓度的乙醇为溶剂，对陕产黄精中总黄酮的提取工艺进行研究，通过正交实验得出影响黄精总黄酮提取率的四个因素顺序为：固液比>乙醇浓度>提取时间>提取温度，获得的最佳的提取条件为：采用60%的乙醇，当固液比为1:15（g: mL），在80℃的条件下回流提取2h，该条件下总黄酮的提取率为0.978%。通过对黄精总黄酮提取物进行活性测试，结果表明该提取物对DPPH自由基和羟自由基均有一定的清除作用。
关键词：黄精 总黄酮 清清除自由基
黄精，为百合科黄精属植物，其干燥根茎可入药，其味甘性平，主要含有黄精多糖、黄酮、皂苷、氨基酸及微量元素等多种成分，具有补中益气、益肾强骨、健脾润肺、增强免疫功能、延缓衰老、调血脂、降血糖等功效[1,2]。
总黄酮广泛存在于植物体中，近年来国内外学者对黄酮类化合物的化学成分和药理作用进行研究[3,4]，结构表明总黄酮是心血管、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、镇痛以及消化系统等方具有积极的作用[5]。
目前关于总黄酮，尤其是陕产黄精总黄酮的提取工艺尚未见报道。本文以陕产黄精为研究对象，以乙醇为溶剂采用回流的方法提取其中总黄酮，以总黄酮提取率为考察指标，通过正交实验优化提取工艺条件，并研究总黄酮对自由基的清除作用，以期为陕产黄精黄酮的药用、食用及日化产品的开发提供参考。
1 实验材料与仪器
主要试剂：芦丁标准品；硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠等均为分析纯。
原料：黄精（产地陕西，购自西安药材市场）。
主要仪器与设备：722可见光分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；粉碎机(九阳股份有限公司)；AR2130型电子天平 (上海天普分析仪器有限公司)。
2 实验内容
2.1 陕产黄精样品前处理 选取质地均匀陕产黄精，清水洗净，沥干，于50℃烘箱中烘干，粉碎后过60目筛，保存在阴凉干燥处待实验用。
2.2提取工艺 称量一定量的陕产黄精，以乙醇为溶剂，在一定温度下加热进行提取后，采用真空泵进行抽滤，并对滤液进行蒸发浓缩至粘稠。
2.3 标准曲线的绘制
（1）标准溶液的配制 精确称取减压干燥至恒重的芦丁24.3mg于100mL烧杯中，用30%乙醇溶液溶解后转至1000mL容量瓶内，定容至刻度，配成0.0243mg/mL的对照品溶液。
（2）标准曲线的绘制
精确吸取溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分别置于25mL容量中。用30%乙醇补至12.5mL，分别加入0.05%亚硝酸钠溶液0.56mL，摇匀，放置5min后，再加0.1%硝酸铝溶液0.56mL，再把溶液摇匀，放置5min后，加入4%NaOH溶液4mL，混匀，加30%乙醇至刻度后静置10min，以溶剂为空白参比，在510nm波长下测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线。
2.4 正交实验
在单因素实验的基础上，采用L9 (34)的正交实验对影响陕产黄精中黄酮物质提取效果的主要影响因素（A：提取温度；B：乙醇浓度；C：固液比；D：提取时间）进行考察研究。
表1 四因素三水平正交实验表
2.5总黄酮对自由基的清除作用的研究
2.5.1 对DPPH的清除作用研究
黄精总黄酮提取物溶液用蒸馏水制成50、100、150、200、400、600mg/L测定液备用，同时配制2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液。分别取各浓度提取物测定溶液2.00mL，加入DPPH乙醇溶液2.00mL，摇匀后放置30min，以溶剂为对照，分别测定在517nm处的吸光度值Ai。然后取各浓度提取物溶液2.00mL，与2.00mL乙醇溶液混合后在517nm处的吸光度值Aj。再测2.00mLDPPH乙醇溶液于2.00mL溶剂混合后在517nm处的吸光度值Ac。自由基的清除能力用抑制率K表示。计算按下式 : K=[1-(Ai-Aj/Ac)]×100%
2.5.2对羟自由基的清除作用研究
准确称取黄精黄酮提取物蒸馏水制成1000mg/L溶液。并用蒸馏水将该溶液稀释成 10、50、100、200、400、600mg/L测定液备用。
3 实验结果
3.1标准曲线的绘制结果
经紫外可见分析，得出标准曲线的方程为：A=0.1105C+0.0016，r=0.9981,线性范围为：0.0097～0.0486，如图1所示：
图1 芦丁标准曲线
3.2正交实验结果
对A提取温度、B乙醇浓度、C固液比、D提取时间等影响黄酮提取率的因素进行正交实验，结果如表2所示。
一个因素对实验指标影响的大小，由这个因素的水平变化所引起的K值波动幅度大小来决定，即由极差R值决定。R值大，说明该因素的水平变化对指标的影响大，这个因素是主要因素。R值小，说明该因素的水平变化对指标的影响小，这个因素是次要因素。
表2正交实验结果
表2数据表明，乙醇浓度、提取时间、固液比、提取温度等四个因素对陕产黄精黄酮提取量影响的主次顺序为：C固液比>B乙醇浓度>D提取时间>A提取温度，并且最佳的提取条件为A3B1C3D2，即提取温度80℃、乙醇浓度60%、提料液比1:15（g: mL）、取时间2h，当工艺参数下提取陕产黄精中总黄酮类提取率0.978%。
3.3总黄酮清除自由基的作用结果
3.3.1对DPPH自由基的清除作用研究
对表3可看出黄精总黄酮黄提取物除DPPH自由基有较强的清除能力，当总黄酮浓度为24.4mg/L时。对该自由基地抑制率达到41.74%。
表3 对有机自由基的清除作用
3.3.2对羟自由基的清除作用的研究
黄精提取物对羟自由基的清除作用实验结果见表4。可看出黄精总黄酮提取物除有机有较强地清除自由基力，当总黄酮浓度48.4mg/L时，对羟基机自由基地抑制率达到28.31%。
表4 对羟自由基的清除作用
4.结论
本实验通过对陕产黄精中总黄酮类的提取工艺进行研究，得出影响黄精总黄酮类提取率的四个因素主次顺序为：固液比>乙醇浓度>提取时间>提取温度，获得的最佳的提取条件为：提取温度80℃，乙醇体积分数60%、提取时间2h、固液比1:15（g: mL）。该工艺条件下，总黄酮的提取率达0.978%。通过对黄精总黄酮提取物进行有机自由基的清除作用实验，结果表明，该提取物对DPPH有机自由基、羟自由基均有一定的清除作用。干研究对于黄精的进一步开发提供参考。
黄精总黄酮受到产地、气候、品种、采收时间等许多因素的影响，其成分也变得很复杂，仅以主要成分含量作为指标不能很好的控制其质量，后期的研究可进一步建立黄精总黄酮成分的指纹图谱，全面反映其所含内在化学成分的种类与数量，进而控制其质量。
参考文献
[1]范佐旺,柯晓燕,陈靓雯,孟永海.多花黄精的化学成分及药理研究进展[J].中医药信息,2020,37(05):119-126.
[2]王硕.黄精的研究现状[J].农业科技通讯,2020(01):46-47.
[3]王丹,张鸿,刘嘉丽,满琪,董新荣,刘德明,黄立新.不同产地多花黄精生物活性成分含量比较[J].湖南农业科学,2020(07):89-92+96.
[4]杨泽娃,谭华影子,陈巧云,胡雪琪,武芸,陈治宇.正交法优化黄精地上茎叶中有效成分的提取工艺[J].湖北农业科学,2020,59(12):139-144.
[5]何兰香,丁科,谢明华,计莉强,葛敏.酶法-超声提取黄精总黄酮及其抗氧化活性研究[J].中国现代应用药学,2019,36(09):1075-1080.
[6]王文君,向灿辉,刘成红.黄精总黄酮的提取与性质分析[J].食品工业,2014,35(10):258-262.