王俊丽
(山东职业学院，济南，250100)
摘要 红茶菌俗称“胃宝”，是由醋酸菌、酵母菌、乳酸菌以糖茶水为原料制成的发酵饮料。根据红茶菌中三类菌的性质及特点，选择合适的分离培养基和培养条件，在红茶菌菌种中分离得到了三类不同的纯菌：2株酵母菌、2株醋酸菌、1株乳酸菌，单独保存、使用分别前活化扩培，然后按不同组合方式接种、混合发酵，可以获得不同感官和营养成分的红茶菌发酵饮料。
关键词：红茶菌；功能性发酵饮料；菌种分离；混合发酵
中图分类号 G712 文献标识码 A
1 红茶菌中的微生物种类及其功能
红茶菌是一种历史悠久的民间传统功能性茶饮料，是以糖茶水为原料，经红茶菌中的多种微生物共同发酵而成的。红茶菌液中富含乳酸菌,酵母菌,醋酸菌等对人体有益的微生物活性菌，以及在发酵过程中生成的醋酸、乳酸、葡萄糖酸及维生素C等有益物质。
红茶菌中的三类功能菌及其作用：
1.1 酵母菌
红茶菌液中的酵母大多为茁芽酵母属和德氏酵母属两种。几乎一切的酵母菌都能发酵三种单糖，即葡萄糖、果糖、甘露糖，很多种酵母也能发酵半乳糖。
酵母菌含核蛋白量丰富，具有人体必需的八种氨基酸，还有多种维生素和有益酶。它在糖液中分解，除生成许多有机酸、氨基酸、维生素等营养物质外，在酵母菌的细胞壁上还产生一种胶状抗癌物质，称为"B古鲁千"，这是在抗癌药物中很被注意的一种。
1.2 醋酸菌
醋酸菌是红茶菌的主体，在糖茶水中能生成醋酸，醋酸具有保护维生素的作用，因维生素在酸性环境中不易被破坏，醋酸是预防痢疾的良药，具有解毒的功能，更重要是它还具有抗癌、防癌的保健功效。
醋酸菌可使体内营养充分化为能量，可抑制肠内有害细菌，对肠胃运动和健康有益。
1.3 乳酸菌
乳酸菌含有适量的糖化酶，能把食物中未消化的糖类分解为葡萄糖，以供给乳酸菌生长、繁殖和产生乳酸的需要。
乳酸菌是能清理肠道、抑制肠内异常发酵、制止和阻挡人体吸收有害菌分解生成的毒素、使人体机能免于迅速老化，被认为是人体的健康卫士。
2 红茶菌中微生物分离的必要性
红茶菌属于混合菌种，各种菌之间会产生对发酵基质中的营养成分的争夺、以及代谢产物的抑制等相互干扰，对发酵过程及产品组成有很大影响。红茶菌发酵试验已证明：红茶菌菌源的不同、红茶菌种的菌类组成比例及接种数量不同、红茶菌种形式（菌液、菌膜）的不同、操作不当而导致污染杂菌、而且传代使用次数过多易发生菌种性能衰退乃至变异等，所以红茶菌的传统粗放式发酵方式使发酵过程菌类比例难以把握、发酵代谢产物难以控制，影响到红茶菌发酵液成分、发酵液酸度、感官及理化质量等，从而引起发酵产品的营养成分及口味的变化，发酵产品质量不稳定、品质差，一旦污染有害杂菌还会引发安全性问题。
红茶菌菌种稍有差别，经发酵得到的红茶菌液的成分和质量就会不同。而如果将红茶菌中的三种菌分离出来、分别进行保存、纯菌接种、混合发酵，那么菌种的菌类及数量就可以进行控制，从而保证其他条件相同的情况下菌种的稳定性，就可以控制三种菌的比例及数量，使发酵过程中代谢产物相对稳定、产品质量保持稳定。所以探索对红茶菌进行分离、单独保存、按需进行分别接种，来保证菌种的组成和比例，非常必要并且有生产应用价值。
3 红茶菌中微生物分离及保存方法
3.1 菌种分离材料
3.1.1 菌种：红茶菌混合菌种，购买自某生物技术公司。
3.1.2分离用培养基：
3.1.2.1 红茶菌培养基
红茶菌培养基：蔗糖 5 g ，红茶粉 0.2 g ，蒸馏水 100 mL 。 115 ℃ 灭菌 15 min 。
3.1.2.2 酵母菌培养基
Y1 号：酵母膏 1 g ， 蛋白胨 1 g ，葡萄糖 2 g ，琼脂 2 g ，蒸馏水 100 mL 。 待培养基冷却至 50 ℃ ，添加 100 mg/L 盐酸氧四环素。
Y2 号：麦芽膏 2 g ，琼脂 2 g ，自来水 100 m l。
3.1.2.3 醋酸菌培养基
醋酸菌培养基：酵母膏 1 g ， 葡萄糖 1 g ，琼脂 2 g ，放线菌酮 0.5 mg，蒸馏水 100 mL 。 待培养基冷却至 50 ℃ 时，加入 2 g 经 165 ℃ 干热灭菌 30 min 的 CaCO3 和 3mL 的95% 乙醇。
3.1.2.4 乳酸菌培养基： MRS 培养基（分离乳杆菌)
3.2 菌种分离方法
3.2.1 菌种活化
采用红茶菌培养基，将红茶菌种接种培养后得到活化的红茶菌菌种，振荡混匀，吸取10 ml 菌液并夹取一小块菌膜放入带玻璃珠的 90ml无菌水中，充分振荡，使溶液混匀。
3.2.2 菌种稀释、涂布接种
吸取 5 ml 混匀的活化液转入45 ml无菌水中得到10—1的稀释液，依次梯度稀释成 10—2，10 —3，10 一4，10一5，10一6，之后分别吸后 3 个稀释度的菌液各0.2 ml分别涂布于酵母菌培养基、醋酸菌培
养基和 MRS 培养基上，用玻璃棒涂布均匀，30℃培养，得到分离纯化的单菌落。每个稀释度重复3 次 。
3.2.3 纯菌培养、镜检
醋酸菌和乳酸菌培养基于30 ℃培养，酵母菌培养基于 28 ℃培养，培养时间3～5天 。每天观察菌落生长情况和外观形态。培养结束，挑取单菌落转接保存纯菌（见步骤3.3、），然后将相应菌落剩余部分进行镜检初筛、于显微镜下观察各菌落中的细胞形态及初步判断菌类。
3.3 菌种分离与保藏
培养结束，根据菌落生长情况和菌落形态，先挑取生长良好、具有典型性的单菌落接种于各类菌的固体斜面培养基中进行培养，低温保藏、备用。从混合菌种中分离出5株纯菌，分别是：2株酵母菌，2株醋酸菌，1株乳酸菌。得到了纯菌种，就可以解决菌种保存、接种量控制、控制杂菌污染、保持菌种活力和控制产品质量等多方面的问题。
4 纯菌接种、混合发酵
将分离得到的各个纯菌种进行扩培，然后按设定比例分别接种，最后进行混合发酵。
4.1 纯菌逐级扩大培养
分别挑取分离保存的酵母菌、醋酸菌、 乳酸菌纯菌，活化后分别接入各类菌的液体培养基中扩大培养。根据发酵生产所需的菌种量，扩大培养各菌液的体积和数量，必要时进行多级培养。
酵母菌于30 ℃、100 r/min 振荡培养 32～36 h ；醋酸菌于30℃、200 r/min 振荡培养 32～36 h；乳酸菌于30 ℃ 静置培养 32～36 h 。
4.2 纯菌分别接种
根据酵母菌、醋酸菌、 乳酸菌的浓度（可镜检计数或测OD值），按 5％ 总接种量（按事先设定的酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的配比）换算成各种菌实际的接种量，无菌操作接入红茶菌培养基中，注意控制无菌条件。
4.3 混合发酵
将各纯菌的扩培液接入糖茶水的发酵缸中，总体积不大于培养缸体积的2／3，并以四层纱布覆盖扎紧。经30℃、100 r/min 振荡培养3-4天，即可得到成熟的红茶菌液。
可通过调整不同菌种的组成和配比、改变发酵条件等，得到不同风味和功效成分的红茶菌发酵饮料。
5结论
红茶菌是一个复杂的微生物共生体系，由酵母菌、醋酸菌和乳酸菌组成，不同来源的红茶菌，其优势菌种组成及类型也不尽相同。分离出纯菌种后、采用不同的菌种组合方式，进行纯菌混合发酵生产红茶菌，并与传统酿造的红茶菌进行感官比较，结果表明不同组合方式纯菌混合发酵生产的“红茶菌”其酸甜比、口感及风味有差别，这可能是由于发酵过程中菌群处于不同的生长状态，从而影响代谢产物的合成。
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