张杰
沈阳九州家圆医院 辽宁 沈阳 110013
【摘要】目的：研究并分析激光辅助孵化（LAH）对反复种植失败患者冷冻周期妊娠结局的影响。方法：选取2016年01月～2017年12月在我院入院治疗的反复种植失败患者240例，按照是否进行激光辅助孵化随机分为激光辅助孵化组（LAH组）120例和未行辅助孵化组（对照组）120例。分析两组患者的胚胎种植率、临床妊娠率、流产率和活产率等。结果：两组患者间的年龄、BMI、子宫内膜厚度、既往移植次数、不孕年限、不孕原因、不孕类型等差异无统计学意义（P＞0.05）。两组患者周期特征比较，LAH组的优质胚胎个数多于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），其余指标差异均无统计学意义（P＞0.05）。两组妊娠结局比较，LAH组的种植率、临床妊娠率及活产率显著高于对照组(P＜0.05)，流产率显著低于对照组(P＜0.05)，差异有统计学意义。结论：将激光辅助孵化技术应用在反复种植失败患者中，能明显改善其冷冻周期妊娠结局。
【关键词】激光辅助孵化；反复种植失败；冷冻周期；妊娠结局；种植率；临床妊娠率
在过去40年，体外受精和胚胎培养技术得到飞速发展，胚胎种植率目前可高达50%以上［1］。然而，仍有5%～10%的女性经历多个助孕周期治疗亦不能获得预期的妊娠结局［2－3］，反复种植失败（Repeated Implantation Failure,RIF）被认为是阻碍妊娠率进一步增长的瓶颈问题。近年来研究发现囊胚不能从透明带中正常孵出，可能是胚胎种植失败的原因之一[4]。针对透明带变厚变硬可能会对胚胎孵出造成机械障碍这一问题，辅助孵化(assisted hatching, AH)是通过机械法、化学法或者激光法对胚胎透明带实施薄化、开孔或者部分切除处理, 以帮助囊胚从透明带中孵出而提高胚胎种植率的一种辅助生殖技术, 常用于患者年龄超过38岁、多次IVF治疗失败及冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer, FET)周期中[5]。现有研究［6］表明，激光辅助孵化法(Laser assisted hatching，LAH)是一种简便、快速、安全的方法。本研究旨在研究并分析激光辅助孵化技术对反复种植失败患者冷冻周期妊娠结局的影响，现对收治的相关资料进行回顾、总结与分析。
1 资料与方法
1.1一般资料
选取2016年01月～2017年12月在我院入院治疗的240例反复种植失败患者纳入研究。纳入标准：①移植２级以上胚胎≥３次且未妊娠者；②解冻移植２枚优质常规体外受精胚胎；③内生殖器官无器质性病变。排除标准：①近期有激素类药物用药史；②内分泌障碍者；③有其他全身性疾病；④子宫内膜异位症患者；⑤子宫腺肌症患者。根据纳入及排除条件，共纳入符合条件者 140例，其中激光辅助孵化组（LAH组）120例，未行辅助孵化组（对照组）120例。两组患者间的年龄、BMI、子宫内膜厚度、既往移植次数、不孕年限、不孕原因、不孕类型等差异无统计学意义（P＞0.05）。患者均在知情同意后行LAH，且所有患者在治疗周期中依从性较好，无患者退出治疗。
1.2干预方式
（1）促排卵方法
采用常规微刺激方案（克罗米芬+注射用尿促性素）进行促排，阴道超声监测卵泡生长情况，当患者主导卵泡直径≥18mm时，给患者肌肉注射8000IU人绒毛膜促性腺激素（humanchorionic gonadotropin，hCG）（丽珠制药）或皮下注射达菲林（益普生法国生物技术公司）0.2mg，在34～36h后对患者进行阴道超声引导下取卵[7] 。
（2）胚胎培养及冷冻
根据患者适应证选择相应的受精方式，IVF或ICSI, 在取卵后第3日根据胚胎的生长速度、形态学等指标进行评分，选择可移植的胚胎进行移植或冷冻，采用加藤(KITAZATO)公司生产的快速玻璃化冷冻（VT101）、解冻试剂（VT102）进行玻璃化冷冻和解冻，操作按试剂盒说明书要求进行。冷冻程序为：首先将胚胎移入1液中1min，然后转入2液3～5 min，最后转入3液中30s，迅速放入冷冻麦管投入液氮，操作均在室温下进行。解冻程序为：迅速将冷冻麦管胚胎端置于1液中1min(37℃)，依次移入2液、3液、4液中各3min(室温)，最后将胚胎移入G-2 培养液，放于37℃、体积分数6% CO2培养箱中。存活胚胎的标准为完整细胞数>50%。解冻后将胚胎置于培养滴内进行LAH，培养2h后移植。
（3）解冻周期内膜准备
本周期行解冻胚胎移植的患者均为移植２级以上胚胎≥３次而未孕的患者。①自然周期：于月经第９天行阴道超声监测，当内膜厚度＞７mm，于排卵日至移植日分别给予黄体酮（浙江仙琚制药股份有限公司）肌肉注射20mg、40mg、40mg、60mg。排卵后3d行解冻胚胎移植；②激素替代周期：于月经第３天给予口服补佳乐(戊酸雌二醇, 1mg/片, 拜耳医药保健有限公司)或芬吗通(雅培公司)6～8mg/d，月经第９天行阴道超声监测，当内膜厚度＞7mm后至移植日分别给予黄体酮（浙江仙琚制药股份有限公司）肌肉注射20mg、40mg、40mg、60mg，3d后行FET。
（4）激光辅助孵化（LAH）
采用Saturn 5 Active型非接触式透明带红外激光光学系统（Research Instruments Ltd，英国），选择胚胎卵周间隙最大部位，依次发射激光削薄透明带，削薄区域为1/4 透明带周长、深度为透明带厚度的50%～80%，不穿透内侧透明带。完成操作后在培养液中移入胚胎进行2h的培养移植[8]。
1.3观察指标：观察指标包括胚胎种植率、临床妊娠率、流产率和活产率。
1.4观察指标评价方法
临床妊娠是指胚胎移植后28～35d行超声检查，至少有1个孕囊且可见原始心管搏动；流产指妊娠不足28ｗ、胎儿体质量＜1000ｇ而终止者；生化妊娠是指移植后14d检测血hCG＞25IU/Ｌ。临床妊娠率＝临床妊娠周期数/移植周期数×100%；胚胎种植率＝宫内孕囊个数/移植胚胎个数×100%；流产率＝流产周期数/临床妊娠周期数×100%；活产率＝活产周期数/移植胚胎周期数×100%。
1.3 统计学方法
本次实验数据采用专业化的分析软件进行统计学分析（SPSS21.0），其中，计量资料采用均数±标准差（±s）或率（%）来表示，组间对比采用t检验，计数资料对比采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
（1）两组患者周期特征比较
LAH组优质胚胎个数显著优于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），其余指标差异均无统计学意义（P＞0.05），具体数据如表1所示。
.png)
（2）两组妊娠结局比较
LAH组的种植率、临床妊娠率及活产率显著高于对照组(P＜0.05)，流产率显著低于对照组(P＜0.05)，差异均具有统计学意义，具体数据如表2所示。
表2：两组妊娠结局比较（%）
.png)
3 讨论
随着现代科技的不断发展与进步，人类辅助生殖技术得到了创新性的发展，为那些不孕不育患者带来了更多的生育机会，是广大因各种原因而不能生育的夫妇的福音。但是，反复种植失败仍成为临床生殖工作十分棘手的问题，如何使反复种植失败患者得到一个较好的妊娠结局，减少其流产率，提高其活产率是目前广大临床医生的努力的方向。大量研究表明，辅助孵化应用到人类辅助生殖技术中已有多年，其与激光系统的联合运用取得了良好的效果［9］。对于反复种植失败者来说，激光辅助孵化的方式优势在于克服了透明带变厚、变硬而产生的胚胎孵出机械障碍，同时允许胚胎更早孵出，促进胚胎的发育和种植。合理应用辅助孵化技术，可以有效提升活产率，减少了流产问题的发生。近年来随着显微激光医学的不断发展，激光系统因其快速、准确、安全等优越性被引入辅助孵化技术，从而形成了激光辅助孵化技术，并在临床应用中取得了显著的效果［10］。
在哺乳动物中，随着胚胎的发育，透明带(zonapeltucida)逐渐变薄，胚胎穿出透明带的过程称为孵出。胚胎顺利孵出是成功植入的先决条件。孵出的过程包括囊胚腔不断地扩张，透明带因囊胚腔的压力开始变薄，胚胎通过最薄弱的地方挤出，留下完整的透明带[11]。在辅助生殖技术中，体外的各种操作可能会使胚胎的透明带发生硬化[12]，使得胚胎的孵出和植入受到影响。辅助孵化(AH)是对胚胎透明带进行削薄、打孔或者进行部分切割处理，帮助胚胎从透明带中孵出，从而提高种植率的技术，常用的方法主要有化学法、机械法或者激光法[13]。激光AH技术使用非接触式红外二极管激光器，通过显微镜物镜传递方式作用于靶区域，使得透明带被快速、可控地显微切割，该技术操作简易且精准，已被广泛用于临床[14]。临床上反复种植失败患者以高龄女性居多，高龄女性的卵母细胞质量相对较差，且透明带普遍增厚，对其行辅助孵化显得尤为必要。本研究旨在探讨激光AH技术是否可以改善反复种植失败患者冷冻周期的妊娠结局，并随访种植率、临床妊娠率、流产率和活产率，评估AH应用的可行性，从而为指导临床实践提供依据。
本研究结果表明，对于反复种植失败患者解冻周期中使用辅助孵化技术可以显著改善其妊娠结局，提高其种植率、临床妊娠率和活产率。同时，结果表明透明带薄化激光辅助孵化技术并不会增加种植胚胎的流产风险, 可以安全地应用于反复种植失败患者解冻周期。但本研究仍存在一定的局限性，所得结论仍然需要大样本、高质量的随机对照试验进一步证实。
参考文献：
[1]Niederberger C，Pellicer A，Cohen J，et al. Fortyyears of IVF[J]. Fertil Steril，2018，110（2）：185-324.
[2]全松，刘靖．反复种植失败的定义及影响因素[J]．实用妇产科杂志，2018，34（5）:321-324.
[3]王秀霞，李达．辅助孵化技术新证据[J]．生殖医学杂志，2017,26（7）：627.
[4]祁静，王致辉，宁冰雪，范莹露，张萌，腊晓琳，巩晓芸．反复种植失败与辅助孵化的系统评价[J]．新疆医科大学学报，2020,43（5）：587-592.
[5]The Practice Committee of the American Society for Repro-ductive Medicine.The role of assisted hatching in in vitro fertilization: a review of the literature. Fertil Steril, 2004,82(Suppl 1):s164-5.
[6]Kanyo K，Konc J，Solti L，et al．Assisted reproductive research:laser assisted hatching and spindle detection(spindle view technique)[J]．Acta Vet Hung，2004，52(1):113.
[7]Roh S,Kim SW,Jung YG,et al.Improvement of pregnancy rate by intrauterine administration of dexametha-sone and recombinant human leukemia inhibitory factor at the time of embryo transfer in cattle[J]. J Vet Sci,2016,17(4):569-576.
[8]王兴玲，覃瑶琴，管一春，等.玻璃化冻融和程序化冻融胚胎移植的妊娠结局比较[J]．生殖与避孕，2012，32（4）：273.
[9]Kanyo K，Konce J，Solti L，et al．Assisted reproductive research：laser assisted hatching and splindle detection (splindle) view technique[J]．Acta Vet Hung，2004,52（1）：113～123．
[10]KANYO K，KONC J，SOLTI L，et al. Assisted reproductive research：laser assisted hatching and spindle detection（spindle view technique）[J]. Acta Vet Hung，2004，52（1）：113-123.
[11]Kirkegaard K，Hindkjaer JJ，Ingerslev HJ．Hatchingof in vitro fertilized human embryos is influenced by fertilizationmethod[J]．Fertil Steril，2013，100：1277-1282．
[12]Nada AM，E1-Noary A，Al-Inany H，et a1．Effect of laser assisted zona thinning，during assisted reproduction，on pregnancy outcorue in women with endometriosis：randomized controlled trial[J]．Arch Gynecol Obstet，2018，297；52-528．
[13]陈曦，粱蓉，石程。等．透明带薄化法激光辅助孵化对慢速冷冻和玻璃化冷冻卵裂期胚胎临床结局的影响[J]．生殖与避孕．20I 1，3I：671-675．
[14]Wong BC，Boyd CA，I。anzendorf SE．Randomized controlled study of human zona
Pellucida dissection using the zona infrared laser optical system：evaluation of hiastomere damage，embryo development，and subsequent hatching[J]．Fertil Steril，2003，80：1249 1254．