王婷1，王乐鹏1，蒋海旭，王鹤淞，赵璐，黄光瑞，袁凯*
北京中医药大学（北京 100029）
摘要 目的：通过网络药理学和分子对接分析增液汤治疗II型糖尿病的作用机制。方法：通过TCMSP数据库和BATMAN-TCM数据库确定增液汤成分。TCMSP和BATMAN-TCM数据库预测筛选成分后，使用SwissTargetPrediction预测成分靶点。对于II型糖尿病，使用DrugBank和GeneCards数据库判断靶点。此后，将增液汤的靶点与II型糖尿病的靶点进行映射，取得交集靶点。在STRING数据库中得到PPI网络。将STRING数据库得到的PPI网络导入 Cytoscape 软件，利用cytoHubb插件拓扑分析。通过Degree、closeness、betweeness对核心靶点进行筛选，获得增液汤治疗II型糖尿病的核心靶点。获得核心靶点后，使用GO和KEGG功能富集分析得到相关生物学过程与通路。分子对接中，采用pymol和Discovery Studio 2016 Client软件对接结果进行可视化分析。结果：增液汤中有39个化学成分，药物靶点共有631个。II型糖尿病有235个靶点。映射后得到二者共有交集靶点 30个。筛选之后20个增液汤治疗II型糖尿病的核心靶点。GO和KEGG分析发现增液汤通过调节炎症与代谢治疗II型糖尿病。结论：增液汤通过调节炎症、代谢等相关靶点治疗II型糖尿病。
关键词：增液汤；II型糖尿病；炎症；代谢
Based on network pharmacology and molecular docking to discover the mechanism of Zengye Decoction in the treatment of type II diabetes
Yuan Kai, Wang Ting, Wang He-song, Zhao Lu, Huang Guang-rui
Abstract Objective: To analyze the mechanism of Zengye Decoction in the treatment of type II diabetes through network pharmacology and molecular docking. Methods: Determine the components of Zengye Decoction through TCMSP database and BATMAN-TCM database. After identifying components, we used SwissTargetPrediction to predict component targets. As for type II diabetes, we used the DrugBank and GeneCards databases to determine the target. The target of Zengyetang and the target of type II diabetes were mapped to obtain the intersection target. We used STRING database to obtain PPI network. Then, we used the cytoHubb plug-in to analyze the topology. The core targets were screened by Degree, closeness, and betweeness,. After obtaining the core targets, we used GO and KEGG functional enrichment analysis to obtain the relevant biological processes and pathways. In molecular docking, the docking results of pymol and Discovery Studio 2016 Client software are used for visual analysis. Results: There have 39 chemical components in Zengye Decoction, and there are 631 drug targets in total. Type II diabetes has 235 targets. There are 30 intersecting targets after mapping. After screening, 20 core targets of Zengye Decoction were obtained. GO and KEGG analysis found that Zengye Decoction treats type II diabetes by regulating inflammation and metabolism. Conclusion: Zengye Decoction treats type II diabetes by regulating inflammation, metabolism and other related targets.
Keywords: Zengye Decoction; Type II diabetes; inflammation; metabolism
II型糖尿病是一种慢性疾病，会影响人体代谢糖（葡萄糖）的方式[1]。当人体对胰岛素产生抵抗力或胰腺无法产生足够的胰岛素时，就会发生II型糖尿病。对于II型糖尿病病人，会出现口渴、尿频、消瘦、疲劳、视物模糊等症状[2]。超重是II型糖尿病的主要危险因素。此外，年龄、家族史等也会影响II型糖尿病的发病[3]。II型糖尿病曾经被称为成人发病型糖尿病，但如今，更多的儿童被诊断出患有该疾病，这可能是由于儿童肥胖症的增加所致[4]。目前尚无治愈II型糖尿病的有效方法，但是减肥，饮食和运动有助于控制该病[5]。
中医根据II型糖尿病的症状特点，如口渴、尿频、消瘦等，将其归入消渴病范畴[6]。消渴病由于先天不足，后天饮食失调，导致的以阴虚燥热为主要表现[7]。病机为阴津亏虚，内热上攻，累计脏腑为肺、胃、肾。并发症出现后，则表示疾病进展加重，阴损及阳，气阴两伤，出现阴阳俱虚的表现。由于消渴病的发病率高，病程长，并发症严重，所以需要有效的治疗手段。中医药在长期的实践过程中，对于改善消渴病的症状、缓解并发症等，均积累了丰富的经验。针对其阴虚燥热的特点，中医处方上给予滋阴增液清热的手段处理。处方常常处以增液汤达到滋阴增液的目的[8]。增液汤组成药物为玄参、麦冬、生地，能够滋阴增液清热。最初首创时是用于阳明温病数日不大便，后世医家常根据其特点运用于消渴病，常获良效。
目前增液汤治疗II型糖尿病的作用机制尚不明确。本研究通过网络药理学研究方法，探讨增液汤在II型糖尿病的治疗作用。我们首先确定了增液汤的活性成分以及其相应的作用靶点，同时确定了II型糖尿病的靶点。此后，建立了增液汤和II型糖尿病的蛋白质-蛋白质作用网络（protein to protein interaction network, PPI）。通过合并两个PPI网络，获得核心PPI网络。运用GO和KEGG分析增液汤治疗II型糖尿病的作用。最后，运用分子对接技术，探讨增液汤中活性成分与靶点蛋白的作用机制。
1. 材料与方法
1.1. 增液汤活性成分与靶点的确定
增液汤的组成为党参、地黄、麦冬。我们使用了3个相关数据库来确定增液汤的靶点。这三个数据库分别是中药系统药理学（TCMSP）数据库和BATMAN-TCM数据库。TCMSP数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）能够搜索中药靶标，分析药物与疾病之间的相关性。在本研究中，TCMSP数据库的筛选条件为药物口服生物利用度（OB≥30%）、类药性指数（DL≥0.18）。BATMAN-TCM数据库是一个专门为研究中医分子机制而设计的在线生物信息学分析工具。本研究中，BATMAN-TCM的筛选条件为P＜0.05、Scorecutoff＞48。通过TCMSP和BATMAN-TCM数据库预测筛选成分后，使用SwissTargetPrediction预测成分靶点。SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）能够预测具有生物活性的小分子的靶标。
1.2. II型糖尿病相关基因的确定
我们使用了2个相关数据库来确定II型糖尿病的靶标。这2个数据库分别是DrugBank数据库和GeneCards数据库。DrugBank数据库（https://www.drugbank.ca/）是有用的生物信息数据库，可提供有关药物和疾病的信息。 GeneCards数据库是一个集成网络数据库，其内容包括转录组学、基因组、蛋白质组、遗传、临床信息等。
1.3. PPI网络构建与核心靶点筛选
在本研究中，我们将增液汤的靶点与II型糖尿病的靶点进行映射，取得交集靶点。将交集靶点传送至 STRING数据库平台。Homo sapiens为研究物种，最高置信度大于0.4。在STRING数据库中得到PPI网络。此后，将STRING数据库得到的PPI网络导入 Cytoscape 软件，利用cytoHubb插件拓扑分析。通过Degree、closeness、betweeness对核心靶点进行筛选。最终获得增液汤治疗II型糖尿病的核心靶点。
1.4. GO和KEGG分析
在研究中，我们使用注释、可视化和集成发现（DAVID）数据库进行GO和KEGG功能富集分析。GO分析是一种功能强大的生物信息学工具，可发现基因的生物过程（biological process, BP），细胞成分（cellular components, CC）和分子功能（molecular functions, MF）。 KEGG信号通路分析是有关基因组，生物通路，疾病和药物的数据库的组合。
1.5. 分子对接
蛋白处理方法：使用pymol去水，分离原配体，之后使用autodook加电荷、加氢，保存为pdbqt格式。配体处理方法：在pubchem上检索下载小分子，格式为sdf，导入ChemBio 3D使其能量最小化且输出3D结构，并保存为mol2格式。使用AutoDock Tools 1.5.6转换为pdbqt格式。对接：运行AutoDock Vina 1.1.2软件进行对接。可视化：采用pymol和Discovery Studio 2016 Client软件对接结果进行可视化分析。
2. 结果
2.1. 增液汤的成分与靶点预测
增液汤包含生地黄、麦冬、玄参三种中药。根据TCMSP数据库和BATMAN-TCM数据库，共确定了39个化学成分。麦冬包含14个化学成分，包括豆甾醇（Stigmasterol）、麦冬素A（Ophiopogonin A）、麦冬钙蛋白C（Ophiopogonin C）等。生地黄包含9个化学成分，包括γ-氨基丁酸（Gamma-Aminobutyric Acid）、血凝素A（Rehmaglutin A）等。玄参包含16个化学成分，包括β-谷固醇（beta-sitosterol）、L-天冬酰胺（L-Asparagine）、番石榴甙（Harpagoside）等。使用SwissTargetPrediction预测成分靶点后，发现增液汤全部药物靶点共有631个。其中生地黄靶点125个，包括ESR1、PGR、CACNA2D1、GRIN2A、GRIN3A、RIPK1等。麦冬靶点290个，包括TYMS、NT5C2、ADK、IMPDH1、ENPP1、SOAT1等。玄参靶点354个，包括SSTR3、VEGFA、FGF1、FGF2、AMY1A等。并构建成分靶点网络（见图1）。
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图1 增液汤成分靶点网络图。圆形：药物，其中SD代表生地黄，XS代表玄参，MD代表麦冬；长方形：潜在靶点；六边形：药物成分，其中橙色为生地黄成分，粉色为玄参成分，紫色为麦冬成分。
2.2 II型糖尿病靶点预测
本研究中，我们通过DrugBank和GeneCards数据库预测II型糖尿病靶点。DrugBank数据库删除重复值后，共计128个II型糖尿病靶点，包括MGAM、GAA、AMY2A、GLP1R、HMGCR、CYP3A4等。GeneCards数据库经过平均值筛选后剩余118个靶点，包括INS、KCNJ11、GCK、ABCC8、INSR等。两个数据库合并，删除重复值后，发现II型糖尿病共计235个靶点（见图2）。
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图2 2型糖尿病靶点图
2.3. 增液汤治疗II型糖尿病核心靶点分析
将上述增液汤631个靶点与II型糖尿病235个靶点进行映射，得到二者共有交集靶点 30个。将此 30个交集靶点传送至 STRING数据库平台，在STRING数据库中得到PPI网络，该PPI网络共含有节点（nodes）74个，边（edges）617个（见图3）。将STRING数据库得到的PPI网络导入 Cytoscape 软件，利用cytoHubb插件拓扑分析。增液汤治II型糖尿病 PPI 网络中各节点的degree，closeness，betweeness，按各参数评分值排序。具体数值详见表1。通过Degree、closeness、betweeness筛选后获得 20个增液汤治疗II型糖尿病的核心靶点（见图4），包括AKT1、VEGFA、EGFR、SRC、STAT3、ESR1、TNF、CAT、PPARG、MAPK8、MTOR、HRAS、IL1B、F2、PIK3CA、APP、TLR4、IL2、SERPINE1、AR。
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图4 30个交集靶点的韦恩图
2.4. 增液汤治疗II型糖尿病核心靶点GO与KEGG分析
利用DAVID数据库对获得的增液汤治疗II型糖尿病20个核心靶点进行GO和KEGG功能富集分析。在GO分析的生物学过程（biological process, BP）前二十位的生物学过程，包括RNA聚合酶II启动子转录调控、一氧化氮生物合成过程调控、干扰素γ产生的调控、凋亡过程调控、MAPK激酶活性调控、ERK1和ERK2级联反应调控、白细胞介素8调控、脂多糖介导的信号通路等。在细胞成分（cell component, CC）分析中，涉及到质膜、核周、溶酶体、高尔基体等。在分子功能中（molecular function, MF）中，涉及酶结合、蛋白质结合、受体结合、细胞因子活性等。KEGG分析中，前二十位通路包括HIF-1信号通路、ErbB信号通路、FoxO信号通路、Toll样受体信号通路、癌症相关信号通路、雌激素信号通路等（见图5和图6）。
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图6 核心靶点的GO通路富集分析
2.5. 成分靶点分子对接
在本研究中，我们分析了成分靶点网络，对其进行筛选后，发现增液汤的主要成分包括L-天冬酰胺（L-Asparagine），甲基邻苯二酚A（Methyl Ophiopogonanone A），地黄素A（Rehmaglutin A）等。将这三种主要成分与核心靶点中排名前三的蛋白进行分子对接验证。如果自由能小于-4.25 kcal/mol表示化学成分与靶点蛋白具有一定的结合活力。具体结果见表2与图7，8，9。
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图7 Lasparagine与AKT1(A)、EGF(B)、VEGFA(C)相互作用的2D和3D结果图。
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图9 Rehmaglutin A与EGF(G)、AKT1(H)、VEGFA(I)相互作用的2D和3D结果图。
3. 讨论
增液汤出自《温病条辨》，其方组成为玄参30g，麦冬24g，生地24g[9]。具有增液润燥之功效，主治阳明温病不大便。方中玄参可以滋阴生津，麦冬滋阴润燥，生地黄滋阴清热。三者配伍具有增液润燥之功效。此方初创时，用于阳明温病伤阴伤津，大便干结，阴虚内热。后世将其适应症扩大，用于阴津亏虚有热之症候，屡获良效。目前临床上常作为糖尿病、干燥综合症、便秘等疾病[10]。糖尿病在古代属于消渴范畴，症状为多饮多食多尿，体型消瘦。其中消渴分为上消、中消与下消。上消症见多饮烦渴不止，中消见多食而肌肉消瘦，下消见多尿且频。对于消渴的治疗原则，给予养阴生津、清热润燥的准则。
在我们的研究中，发现增液汤治疗II型糖尿病的20个核心靶点，包括AKT1、VEGFA、EGFR、SRC、STAT3、ESR1、TNF、CAT、PPARG、MAPK8、MTOR、HRAS、IL1B、F2、PIK3CA、APP、TLR4、IL2、SERPINE1、AR。AKT1与成纤维细胞功能、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶相关，调节代谢等过程[11]。VEGFA通过调节血管紧张素转化酶与炎症相关，参与糖尿病并发症的形成[12]。EGFR、SRC参与酪氨酸激酶活性[13]。STAT3调节炎性细胞因子包括IFN、IL6、BMP2等[14]。ESR1调节炎性信号传导[15]。TNF调节肿瘤坏死因子（TNF）超家族炎性细胞因子[16]。CAT调节过氧化氢酶，参与氧化应激。PPARG调节脂肪细胞分化，与糖尿病等代谢性疾病相关[17]。其后的靶点包括MAPK8、IL1B、IL2、TLR4参与调节炎性通路与炎性因子[18]。归纳来看，这些基因大多与炎症通路以及调节代谢等过程相关。
此后的功能富集分析包括GO分析中，我们发现增液汤治疗II型糖尿病的炎症相关生物学过程包括干扰素γ产生的调控、MAPK激酶活性调控、ERK1和ERK2级联反应调控、白细胞介素8调控、脂多糖介导的信号通路等。这些相关通路均与炎症相关，可以调节炎症因子的含量与活性。其他的生物学过程包括RNA聚合酶II启动子转录调控、干扰素γ产生的调控、凋亡过程调控与代谢和氧化应激相关。KEGG分析也发现通路与炎症和代谢通路相关。
最后我们分析了增液汤中主要成分与靶点的分子对接。结果发现增液汤中主要成分如L-天冬酰胺、甲基邻苯二酚A、地黄素A等化学成分，可以稳定结合AKT1、VEGFA、EGFR等靶点。说明增液汤可以通过调节炎症反应与代谢相关靶点，达到治疗II型糖尿病的目的。
综上所述，本文通过网络药理学与分子对接的方法，通过多靶点多通路角度，分析了增液汤治疗II型糖尿病的作用机制。发现增液汤通过调节炎症、代谢等相关靶点治疗II型糖尿病。本研究为后续相关实验研究提供了比较坚实的理论依据。
参考文献：
[1] Down S. Type 2 diabetes: prevention, diagnosis and management [J]. Nurs Times. 2015 Mar 4-10;111(10):14-5.
[2] Chatterjee S, Khunti K, Davies MJ. Type 2 diabetes [J]. Lancet. 2017 Jun 3;389(10085):2239-2251.
[3] Weisman A, Fazli GS, Johns A, et al. Evolving Trends in the Epidemiology, Risk Factors, and Prevention of Type 2 Diabetes: A Review [J]. Can J Cardiol. 2018 May;34(5):552-564.
[4] Kao KT, Sabin MA. Type 2 diabetes mellitus in children and adolescents [J]. Aust Fam Physician. 2016 Jun;45(6):401-6.
[5] Forouhi NG, Misra A, Mohan V, et al. Dietary and nutritional approaches for prevention and management of type 2 diabetes [J]. BMJ. 2018 Jun 13;361:k2234.
[6] 蔡永鑫, 高天舒. 消渴分期辨治探析[J]. 湖北中医杂志, 2020, 42(5): 42-44.
[7] 常克. 消渴糖尿病证治条辨[J]. 世界中医药. 2017, 12(8): 1727-1732.
[8] 魏永军, 韩淑芹. 用增液汤加减治疗糖尿病10例报告[J]. 哈尔滨医药. 2004, 24(4): 40.
[9] 吴晓丹, 孙丽英, 马伯艳. 《温病条辨》增液汤功效探析[J]. 南京中医药大学学报. 2007, 23(6): 351-376.
[10] 黄轩, 刘明华, 张卫明, 等. 大承气汤联合增液汤治疗便秘的临床效果[J]. 中国药物经济学. 2019, 14(5): 103-105.
[11] Chu N, Salguero AL, Liu AZ, et al. Akt Kinase Activation Mechanisms Revealed Using Protein Semisynthesis [J]. Cell. 2018 Aug 9;174(4):897-907.
[12] Gao J, Ailifeire M, Wang C, et al. miR-320/VEGFA axis affects high glucose-induced metabolic memory during human umbilical vein endothelial cell dysfunction in diabetes pathology [J]. Microvasc Res. 2020 Jan;127:103913.
[13] Heinzel A, Kammer M, Mayer G, et al. Validation of Plasma Biomarker Candidates for the Prediction of eGFR Decline in Patients With Type 2 Diabetes [J]. Diabetes Care. 2018 Sep;41(9):1947-1954.
[14] Xu L, Li Y, Yin L, et al. miR-125a-5p ameliorates hepatic glycolipid metabolism disorder in type 2 diabetes mellitus through targeting of STAT3 [J]. Theranostics. 2018 Nov 9;8(20):5593-5609.
[15] Fatima LA, Campello RS, Santos RS, et al. Estrogen receptor 1 (ESR1) regulates VEGFA in adipose tissue [J]. Sci Rep. 2017 Dec 1;7(1):16716.
[16] Kalliolias GD, Ivashkiv LB. TNF biology, pathogenic mechanisms and emerging therapeutic strategies [J]. Nat Rev Rheumatol. 2016 Jan;12(1):49-62.
[17] Castellano-Castillo D, Denechaud PD, Fajas L, et al. Human adipose tissue H3K4me3 histone mark in adipogenic, lipid metabolism and inflammatory genes is positively associated with BMI and HOMA-IR [J]. PLoS One. 2019 Apr 8;14(4):e0215083.
[18] Karstoft K, Pedersen BK. Exercise and type 2 diabetes: focus on metabolism and inflammation [J]. Immunol Cell Biol. 2016 Feb;94(2):146-50.
基金项目：国家自然科学基金重点项目（No. 81430099），国家自然科学基金青年科学基金项目（No. 81904142）
作者单位：北京中医药大学（北京 100029）
*通讯作者：袁凯
1.并列第一作者