赵庆亮1 孙亚珂2 王晓玉3 杨荣荣4 刘倩倩5
苏州大学附属理想眼科医院 江苏省 苏州市 215021
摘要：目的：观察铜绿假单胞菌角膜炎激光共聚焦显微镜临床特征及表现，探讨其在铜绿假单胞菌角膜炎诊疗中的价值。
方法：2018.6～2020.06在我院治疗的铜绿假单胞菌角膜溃疡10例，所有患者均经细菌培养出铜绿假单胞菌确诊。入院后1、3、7天，需行板层角膜移植的患者术前及术后均行激光共聚焦显微镜检查，观察治疗不同时间角膜病灶的激光共聚焦显微镜表现。
结果：早期铜绿假单胞菌角膜炎表现为病灶区浅层基质大量炎症细胞，治疗3到5天后炎症细胞减少，但出现角膜基质纤维结构的破坏及细胞密度降低，未在活体角膜病灶中观察到铜绿假单胞菌病原体。
结论：激光共聚焦显微镜在铜绿假单胞菌角膜炎中虽然不能直接确诊病原体，但可观察不同时期角膜基质病变程度，对指导临床治疗具有重要的价值。
关键词：激光共聚焦显微镜；铜绿假单胞菌；角膜炎
铜绿假单胞菌角膜炎是临床较为常见的重症感染性角膜炎，因其病情发展极快，其早期诊断及早期治疗尤为重要，近年来激光共聚焦显微镜作为一种非侵入性、可在分子生物学水平对角膜结构及病原体进行观察的设备，在临床角膜疾病尤其是感染性角膜病中获得了广泛的应用，但其在铜绿假单胞菌角膜炎诊疗中的应用临床报道较少。我们观察了10例铜绿假单胞菌角膜炎的激光共聚焦显微镜特征，探讨其临床意义，报道如下。
1、对象和方法
1.1研究对象
收集2018年6月至2020年6月我院诊断铜绿假单胞菌角膜炎患者共10人，其中男6人，女4人，年龄为21～75岁。患者平均发病时间2.6天。患者都表现为眼红疼、视物不清，裂隙灯检查可见结膜混合充血，角膜病灶表面不同程度脓性分泌物，溃疡灶灰白色混浊，部分患者前房积脓（图1）。
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图1裂隙灯检查可见溃疡灶表面大量脓性分泌物
1.2研究方法
所有患者入院后均行角膜刮片做微生物学查找及培养，其中微生物学查找检出革兰氏染色阴性菌2例，微生物学培养出铜绿假单胞菌10例，微生物学查找以及培养均阴性者不纳入本组病例。所有患者除常规裂隙灯显微镜检查外均行激光共聚焦显微镜检查。10例患者入院后初步诊断铜绿假单胞菌角膜炎后均应用0.5%左氧氟沙星滴眼液及妥布霉素滴眼液5～10分钟一次，强化滴眼两小时后持续30分钟一次滴眼，两到三天后依据治疗效果以及培养结果调整用药。药敏试验，10例患者均对左氧氟沙星、妥布霉素、头孢他啶等敏感。10例患者药物保守治疗3例，药物治疗后联合板层角膜移植7例。所有患者入院后1、3、7天均行激光共聚焦显微镜检查，联合手术患者术前及术后均行激光共聚焦显微镜检查。手术时间选择药物治疗后3到10天，均行同种异体深板层角膜移植，术后继续抗感染治疗，一周后感染无复发局部给予糖皮质激素眼水减轻术后炎症反应。
激光共聚焦显微镜检查方法：应用激光共聚焦显微镜（德国海德堡公司），患者将下巴置于下颌托，头部固定，患者角膜表面麻醉后，显微镜探头通过耦合剂靠近角膜病灶，对不同部位及深度角膜进行扫描，扫描完成后对图像进行观察分析。
2、结果
2.1 早期铜绿假单胞菌角膜炎患者激光共聚焦显微镜检查表现为：溃疡灶边沿可见大量活化的树突状细胞，病灶浅中层角膜基质可见大量高反光圆形炎症细胞（图2），角膜基质细胞形态模糊，深层角膜基质炎症细胞明显少于浅中层，角膜基质细胞形态可见（图3），未观察到细菌菌体。治疗两到三天后感染控制的患者，裂隙灯下可见到溃疡表面分泌物减少，溃疡边界浸润减轻，激光共聚焦显微镜检查可见病灶基质高反光的炎症细胞明显减少，可见大量细胞碎屑（图4），同时浅层及中层角膜基质纤维失去正常结构，基质细胞密度明显降低（图5）。7例行板层角膜移植的患者术前检查除角膜基质炎症细胞及基质细胞纤维结构异常外，5例可见角膜内皮细胞存在正常六边形结构，内皮细胞表面可见部分高反光炎症细胞，病灶区内皮细胞密度与周边健康角膜区未见明显差异（图6）。
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图 6 可见正常的角膜内皮细胞形态，表面少量炎症细胞
2.2 10例患者经药物及手术治疗后感染均控制，3例药物保守治疗的患者治疗后1～3月角膜溃疡完全愈合，遗留部分角膜斑翳，平均最佳矫正视力0.20。7例板层角膜移植手术患者术后一周角膜植片部分水肿，术后1～3月角膜植片水肿消退，植片透明，术后三月平均最佳矫正视力0.25。
3、讨论
随着抗生素的普遍应用以及劳动保护意识的提高，近年来铜绿假单胞菌角膜炎临床发病虽然有所下降［1］，作为眼科临床常见的重症感染性角膜炎，由于其病情发展快，治疗不及时短时间内可导致角膜穿孔而带来严重的并发症，重症患者可致盲甚至眼球摘除，临床治疗困难。因此，其早期诊断及早期治疗尤为重要，患者早期主要依据临床表现以及病史特点，结合临床病灶刮片病原学检查结果高度怀疑本病后早期局部应用光谱抗生素滴眼液高频率滴眼，后期依据病原学培养以及药敏实验结果调整用药，本组患者药敏试验病原菌均对左氧氟沙星、妥布霉素、头孢他啶等敏感，提示我们临床高度怀疑本病时应早期应用此类广谱抗生素。由于铜绿假单胞菌角膜炎在发病过程中，铜绿假单胞菌会分泌大量溶解酶以及细胞毒素导致角膜基质细胞融解破坏，因此重症患者病灶愈合困难，部分患者即使感染控制，也会由于基质细胞的融解导致角膜溃疡穿孔。因此对于重症患者未发生穿孔前及时的板层角膜移植不仅可以有效去除病原菌，而且可以重塑正常角膜结构，恢复部分视功能，减少严重并发症的发生。
激光共聚焦显微镜近年来广泛应用于临床角膜疾病的诊断，可在分子生物学水平对角膜细胞结构及病原微生物进行观察，尤其对于真菌性角膜炎、棘阿米巴角膜炎具有诊断意义［2］。本组确诊的铜绿假单胞菌角膜炎患者激光共聚焦显微镜观察早期表现为浅基质病灶周边大量树突状细胞，考虑早期病灶炎症反应强烈，导致周边角膜免疫反应加强有关。病灶区角膜基质大量高反光的圆形炎症细胞浸润，主要聚集于浅层角膜基质，深层角膜基质明显少于浅层。治疗3到5天后角膜基质炎症细胞明显降低，但出现大量细胞碎屑、基质细胞结构不清等角膜基质破坏表现，考虑与病原菌分泌融解酶及细胞毒素对角膜基质细胞的破坏作用有关。由于细菌菌体小且缺乏特异性结构，因此我们在活体角膜中未观察到铜绿假单胞菌菌体。我们研究表明，激光共聚焦显微镜虽然不能直接确诊铜绿假单胞菌角膜炎，但是对于本病的鉴别诊断以及预后判断具有重要的临床意义。可以早期初步排除真菌以及棘阿米巴感染，有利于指导临床早期针对性用药。我们在治疗3到5天后应用共焦显微镜观察到角膜基质结构的破坏，在活体分子生物学水平证实了铜绿假单胞菌在发病过程中分泌的融解酶及细胞毒素对角膜基质的破坏作用。对于严重的患者我们可依据激光共聚焦显微镜观察到的角膜基质细胞损害情况选择是否行板层角膜移植。同时由于角膜基质的混浊，我们无法通过常规的检查方法判断患者病灶角膜内皮细胞的状况，而激光共聚焦显微镜在部分患者可清晰的观察到角膜内皮细胞的结构及密度，为我们临床行板层角膜移植提供可靠的依据。
参考文献：
［1］张文华,潘志强,王智群.化脓性角膜溃疡常见致病菌的变迁[J].中华眼科杂志,2002, 38(1): 8-12.
［2］熊健,周文天.活体共聚焦显微镜在感染性角膜炎诊疗应用进展[J].中国实用眼科杂志, 2014,32(8): 934-938.
作者简介：赵庆亮，男，研究生学历，副主任医师，主要从事眼科眼表角膜病的临床工作