白建华
黑河市爱辉区农村疾病预防控制中心 黑龙江 黑河 164300
摘要：目的 比较结核病3种实验诊断方法，分析目前分枝杆菌耐药情况。方法 统计2018年11月到2019年11月我中心临床确诊结核病例患者痰标本涂片镜检、培养和LAMP法检测结果，并对分枝杆菌菌种及对治疗药物耐药情况进行统计分析。结果 共有76例资料齐全的结核病确诊病例入选，其中肺结核48例、结核性胸膜炎20例、结核性脑膜炎8例，分枝杆菌涂片镜检阳性率分别为39.58%（19/48）、5%（1/20）、12.5%（1/8），分枝杆菌培养法阳性率分别为45.83%（22/48）、10%（2/20）、25%（2/8），PCR检测阳性率分别为43.75%（21/48）、15%（3/30）、25%（2/8）。经分枝杆菌菌种鉴定，人型结核分枝杆菌占66.0%（33/50）、牛型结核分枝杆菌占18%（9/50）、非结核分枝杆菌占16%（8/50）。结论 目前结核病实验诊断方法主要有涂片镜检、培养和环介导等温扩增LAMP法检测，病原菌以人型结核分枝杆菌为主，对3种主要抗结核药物的耐药率较高。
关键词：结核病；分枝杆菌；耐药性
Comparison of three experimental diagnostic methods for tuberculosis and analysis of drug resistance of Mycobacterium
Abstract: Objective To compare three experimental diagnostic methods of tuberculosis and analyze the current drug resistance of Mycobacterium.Methods The results of microscopy, culture and LAMP detection of sputum specimens from clinically confirmed tuberculosis patients in our center from November 2018 to November 2019 were statistically analyzed, and mycobacterium strains and drug resistance to treatment were statistically analyzed.Results a total of 76 cases with complete data of tuberculosis confirmed cases selected, 48 cases of tuberculosis, 20 cases of tuberculous pleurisy, 8 cases of tuberculous meningitis, mycobacteria smear microscopy positive rate was 39.58% (19/48), 5% (1/20), 12.5% (1/8), mycobacterium culture method positive rate was 45.83% (22/48), 10% (2/20), 25% (2/8), PCR detection positive rate was 43.75% (21/48), 15% (3/30), 25% (2/8).By mycobacterium identification, mycobacterium tuberculosis of human type accounted for 66.0% (33/50), Mycobacterium tuberculosis of bovine type accounted for 18% (9/50), and Mycobacterium non-tuberculosis accounted for 16% (8/50).Conclusion The current diagnostic methods for tuberculosis mainly include smear microscopy, culture and loop-mediated isothermal amplification LAMP detection. The pathogenic bacteria are mainly Mycobacterium tuberculosis, and the drug resistance rate of the three main anti-tuberculosis drugs is relatively high.
Key words: tuberculosis;Mycobacterium;Drug resistance
引言
结核病是目前严重威胁人类健康的重大传染性疾病之一，近年发病率有上升的趋势，我国是世界上22个结核病高负担国家之一，发病率居世界第二位。结核病的实验诊断手段主要有涂片镜检、分枝杆菌培养、PCR基因检测等[1]。其中分枝杆菌涂片镜检和分枝杆菌培养这两种细菌学检测方法是结核病临床诊断与鉴别的“金标准”。提高结核病分枝杆菌的检测速度和检出阳性率，加快报告分枝杆菌药物敏感试验速度，对于结核病的早期诊断、合理用药具有重要意义。
1.资料与方法
1.1一般资料
研究对象为2018年11月到2019年11月我中心临床确诊结核病例患者痰标本共76例，其中，肺结核48例、结核性胸膜炎20例、结核性脑膜炎8例。
1.2方法
涂片镜检法:金胺“O”荧光染色：将标本涂片自然干燥，平放染色架上，加荧光染色剂盖满痰膜，染色10-15min，水洗，加3%盐酸酒精脱色剂盖满痰膜，脱色3-5min，至无黄色，水洗，加0.5%高锰酸钾盖满痰膜，染色1-2min，水洗，待干后荧光显微镜检查。结果报告标准以全国结核病细菌学检验规程为准。
分枝杆菌培养法:痰标本经半胱氨酸4%氢氧化钠法去污染处理，胸水标本经4%氢氧化钠处理，脑脊液标本直接接种培养基。加入约5倍于标本体积的处理液于痰杯中，将标本连同处理液移入50mL离心管，振荡均匀使痰液充分液化；15min后加入pH6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)至50mL，经离心半径8cm，4000r/min离心15min，弃上清液，加1mLPBS于离心管中混匀，当天接种分枝杆菌培养基，取0.5mL接种至BacT/LAERT培养瓶，取0.3mL接种罗氏培养管。
LAMP法：将痰盒，加热管（样本数加1个阴性对照），阴性对照，加热管架，移液器和枪头放置在生物安全柜中。使用移液器将60ul痰液和阴性对照从痰盒转移至加热管。翻转加热管3次，将加热管放入加热模块内，90℃加热5分钟。从包装中取出与加热管等量的吸附管，放置在吸附管架上面。将加热管底部用力旋入吸附管顶端，并拧紧。将吸附管垂直用力震动10次，水平用力甩动10次，充分混合后液体为乳白色或浅黄色。倒置吸附管，使注射帽侧翼与吸附管侧翼对齐，将注射帽推入吸附管，旋转固定。取下帽环将纯化装置的尖端垂直放入反应管内，开始加样，样本量在反应管双刻度之间，盖好反应管的盖子。所有样本加入完成后加入阳性对照，再将全部反应管编号倒置2分钟 ，2分钟后上下翻转5次翻入相应的反应模块中67℃反应40分钟。
结果判定：打开荧光开关，观察样品是否与阳性对照一样有荧光显示，如果有样品有荧光显示则判断为阳性，表明含有结核分枝杆菌，否则判断为阴性，不含有结核分枝杆菌。
1.3统计学方法
采用SPSS20.0进行统计分析，对计量资料采用百分比描述。方法间率的比较采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2.结果
2.1结核病3中实验诊断方法阳性率
分枝杆菌培养阳性率在肺结核检测中高于涂片镜检（P<0.05），与LAMP法检测相比差异较小（P>0.05）；在结核性胸膜炎中，LAMP法检测阳性率>分枝杆菌培养>涂片镜检（P<0.05）；在结核性脑膜炎中，分枝杆菌培养、LAMP法检测阳性率均高于涂片镜检，P<0.05。详见表1。
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2.2结核病病原菌构成比及药敏结果
对76例患者痰标本中分离培养分枝杆菌，对其中50例进行菌种鉴定及药敏试验，经分枝杆菌菌种鉴定，人型结核分枝杆菌占66.0%（33/50）、牛型结核分枝杆菌占18%（9/50）、非结核分枝杆菌占16%（8/50）。
对50株分枝杆菌临床分离株抗结核药物的药敏试验结果进行统计，人型结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素的耐药率分别为18.18%（6/33）、15.15%（5/33）、6.06%（2/33）、18.18%（6/33）；牛性结核分枝杆菌耐药率分别为11.11%（1/9）、11.11%（1/9）、0、22.22%（2/9）；非结核分枝杆菌耐药率较高，分别为87.5%（7/8）、87.5%（7/8）、75%（6/8）、87.5%（7/8）。
3.讨论
结核病是一种由分枝杆菌感染引起的慢性传染性疾病，人与人之间呼吸道传播是结核病传染的主要方式。提高分枝杆菌的检测速度和检出阳性率，尽快报告其药敏结果对预防及诊治结核病有重要意义。
涂片镜检法，方法快速、简单、成本低廉，但敏感性较低，痰标本含菌量达104mL方能检出[2]。分枝杆菌培养由于分枝杆菌生长缓慢，平均约18h分裂一次，故检测时间相对较长。分枝杆菌培养基有改良罗氏固体培养基和液体培养基。改良罗氏培养法不能自动化，需人工定期观察，但成本低，可直观看到菌落形态与颜色。分枝杆菌液体培养法目前已实现自动化，仪器通过检测培养基内细菌的代谢产物来判断细菌的生长情况，阳性瓶必须经涂片镜检确认后方可报告分枝杆菌培养阳性。该方法报告时间相对改良罗氏培养基快，但与接种菌量有关，标本含菌量越多，接种菌量就越大，仪器报告阳性的时间越短。lAMP法是pcr的一种检测方法优点是速度快、灵敏度高、特异性强，占用场地小，对实验室仪器的依赖程度较小，而且试剂成本较低的一种方法，不会对实验室环境要求较高而增加了实验成本[3]。
以上3种建立在检测分枝杆菌基础上的实验诊断方法在结核病防治中发挥了重要作用。
参考文献
[1]王少华,杨翰,李爱芳,崔晓利.三种实验方法检测胸腔积液对结核性胸膜炎的诊断价值分析[J].现代检验医学杂志,2019,34(03):104-108.
[2]张晓梅,夏小明,罗兴燕,胡旺,黄鹏.T-SPOT.TB,TB-Ab联合检测在结核病中的诊断价值[J].实验与检验医学,2018,36(05):663-665+673.
[3]金淑芳.结核病实验室诊断方法的研究进展[J].医学理论与实践,2014,27(07):874-876+858.