林燕清 郭亚 张连海
珠海科域生物工程股份有限公司 珠海 519040
摘要 目的：建立粪便新型冠状病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）抗原胶体金检测试剂的制备方法，并对试剂的性能指标进行初步评价。方法：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，用新型冠状病毒N蛋白抗体作为标记抗体，硝酸纤维素膜上包被另一新型冠状病毒抗体，并用羊抗兔多克隆抗体和兔IgG作为独立质控线系统制备胶体金检测试剂；对试剂的加速稳定性、特异性及临床诊断性能进行评价。结果：试剂盒37℃加速破坏3周稳定。试剂盒与隐血阳性、轮状病毒阳性、腺病毒阳性、诺如病毒阳性、幽门螺杆菌阳性样本无交叉反应。确诊及健康人群样本测试，灵敏度为28.00% (14/50)，特异性为100.00% (120/120)，Kappa值为0.3544（P<0.05）。结论：粪便新型冠状病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）灵敏度不足，不宜用于筛查，若将本检测试剂作为病人出院检测的补充，与呼吸道样本核酸检测一起，可降低潜在的粪口传播风险，为疫情防控增加一道防线。
关键词 新型冠状病毒 抗原 胶体金
新型冠状病毒属于β属的冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60~140nm。病毒对紫外线和热敏感，56℃ 30分钟、乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒。经呼吸道飞沫和密切接触是新型冠状病毒的主要传播途径。在粪便及尿液中可分离到新型冠状病毒。
我国新型冠状病毒肺炎的诊断依照中华人民共和国国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》（以下简称“诊疗方案”）进行，其中用于辅助诊断的检测方法主要为使用实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸及进行病毒基因测序，诊疗方案试行第7版中增加了通过检测血清中新型冠状病毒特异性IgM和IgG抗体作为新型冠状病毒肺炎确诊依据。
胶体金免疫层析技术已广泛应用于病原体抗原及特异性抗体的检测，如轮状病毒抗原、丙型肝炎病毒抗体检测等，均有成熟产品上市。目前已通过国家药品监督管理局注册审批的新型冠状病毒检测试剂主要有基于荧光PCR法的核酸检测试剂盒、基于胶体金法和化学发光法的新型冠状病毒IgM/IgG抗体检测试剂盒。基于胶体金法的试剂，以其反应快速、不需特殊仪器、试剂保存条件简单，在疫情防控中起了重要作用。
本研究采用胶体金免疫层析技术，研制检测粪便中新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，并对试剂盒的性能进行初步评价，评估试剂盒在临床应用中的价值。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1样本来源 确诊病例粪便样本50例；本实验室2019年收集保存的健康人群粪便样本120例，隐血阳性、轮状病毒阳性、腺病毒阳性、诺如病毒阳性、幽门螺杆菌阳性粪便样本各5例。
1.1.2主要试剂 氯金酸、牛血清白蛋白购自Sigma公司；硝酸纤维素膜购自Pall公司；新型冠状病毒抗体对、新型冠状病毒N蛋白购自菲鹏生物股份有限公司；高浓度、低浓度和阴性质控品为本司制备；其他试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 胶体金的制备 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液。向1000mL超纯水中加入40mL 1%氯金酸溶液，混匀后于加热磁力搅拌器上加热至沸腾，快速一次性加入30mL 2%的柠檬酸三钠溶液，当溶液颜色从黑色变为稳定的亮红色后继续煮沸2~3min，关闭加热器，冷却后以超纯水恢复至原体积。用紫外分光光度计对胶体金溶液进行测定，记录波峰λ、波宽Δλ（λB-λA）见图1。
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1.2.2抗体标记条件的选择
1.2.2.1 最佳标记pH的确定 通过加入不同体积的0.2M碳酸钾溶液将胶体金溶液调节至不同pH，向pH值不同的胶体金溶液中加入终浓度为50μg/mL的待标记蛋白，混匀，室温静置20分钟，再加入10%氯化钠溶液，混匀，室温静置1小时，观察各胶体金溶液颜色变化，记录颜色保持不变的溶液所加入的0.2M碳酸钾溶液的体积。
1.2.2.2 最小标记蛋白浓度的确定 按已确定的最佳标记pH值，向胶体金溶液中加入适量0.2M碳酸钾溶液，混匀后加入不同终浓度的待标记蛋白，混匀，室温静置20分钟，再加入10%氯化钠溶液，混匀，室温静置1小时，观察各胶体金溶液颜色变化，记录颜色保持不变的溶液所加入的待标记蛋白的浓度。
1.2.3 金标垫的制备
1.2.3.1 胶体金标记物的制备 取胶体金溶液至干净的烧杯中，按照优化的标记pH 条件，加入0.2M 碳酸钾调整pH，搅拌均匀，加入适量待标记的新型冠状病毒抗体（标记量20μg/mL）、质控线标记抗体（标记量10μg/mL），搅拌均匀，再加入适量10% BSA溶液，继续搅拌均匀；搅拌结束后，离心收集沉淀，用金标垫稀释液复溶至原胶体金体积的1/10，2~8℃避光保存备用。
将胶体金标记物用金标垫稀释液稀释，以46mL/张的液量浸泡玻璃纤维处理成金标垫，将浸泡完成的金标垫进行冻干，冻干后的金标垫在湿度不高于25%的环境下，放入装有硅胶干燥剂的铝箔袋密封，2~30℃保存备用。
1.2.4 稳定性研究 将制备好的试剂卡置于37℃环境下，每隔1周用高浓度、低浓度和阴性质控品进行测试，每个样本重复3次，比较第1周、第2周、第3周、第4周加速破坏试剂与对照试剂（0周）检测结果的差异。
1.2.5 特异性试验 检测粪便隐血阳性、轮状病毒阳性、腺病毒阳性、诺如病毒阳性、幽门螺杆菌阳性粪便样本，考察常见的肠道出血及胃肠道病原体对本试剂检测结果的影响。
1.2.6 临床性能评价 检测确诊病例50例及健康人群120例，统计灵敏度、特异性、总符合率及95%置信区间，分析kappa值，评价本试剂检测结果与临床诊断的一致性。
2 结果
2.1 胶体金溶液测定
使用紫外分光光度计对胶体金溶液进行测定，结果如图2所示，波峰λ约为525nm，波宽Δλ约为90nm。波峰λ在520~530nm范围内，波宽Δλ在≤130nm范围内，表明所制备的胶体金粒径均一，尺寸分布较窄，符合使用需求。
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2.2 抗体标记条件的选择
2.2.1 最佳标记pH的确定
不同pH的胶体金溶液颜色变化情况见表1。
表1 不同pH的胶体金溶液颜色变化情况
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选择0.2M碳酸钾溶液加入量为12.5μL/mL胶体金作为检测线标记蛋白的标记pH。
2.2.2 最小标记蛋白浓度的确定
不同蛋白加入量的胶体金溶液颜色变化情况见表2。
表2 不同蛋白加入量的胶体金溶液颜色变化情况
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选择标记蛋白终浓度为20μg/mL胶体金作为检测线标记蛋白的标记浓度。
2.2.3 加速稳定性
37℃加速稳定性结果见表3。
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结果表明，37℃加速破坏3周，检测线强度与对照相当；第4周时，低浓度质控品的检测线有所变浅。参照《中国生物制品规程》（2000版）对胶体金产品的规定，37℃至少20天的加速稳定性试验，可用于评估有效期18个月的产品性能。据此推测，本试剂盒的效期可达18个月。
2.2.4 特异性
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结果表明，粪便隐血阳性、轮状病毒阳性、腺病毒阳性、诺如病毒阳性、幽门螺杆菌阳性的样本，均未检出阳性结果。由于样本为疫情爆发前收集保存，故预期结果均为阴性，实测结果与预期结果一致，常见的肠道出血及胃肠道病原体的存在不会造成检测结果假阳性。
2.2.5 临床评价
50例检测确诊病例粪便样本及120例健康人群样本临床统计结果见表5。与临床结果比较，本试剂盒检测灵敏度为28.00%（95%CI：16.23%-42.49%），特异性为100.00%（95%CI：96.97%-100.00%），总符合率为78.82%（95%CI：71.91%-84.71%），Kappa值为0.3544（P<0.05）。
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试验结果表明，本试剂盒与临床结果比较，一致性较差，灵敏度不足，特异性良好。可能与本临床评价未对入选的确诊人群进行筛选有关，并不是所有的新型冠状肺炎患者都有消化道症状，病毒未进入消化系统，这种情况下粪便中既检测不出病毒核酸，也检测不出病毒抗原。
3 讨论
病毒核酸检测是确诊感染的重要标准，病毒抗体检测是核酸检测的重要补充。核酸检测需要专门的分子生物实验室及专用设备，对操作人员水平要求较高。抗体检测对实验室条件及操作人员操作水平要求较低，可以广泛开展。但感染初期人体尚未产生病毒特异性抗体，应建立抗原检测免疫学方法用于此时期的辅助筛查。目前尚无新型冠状病毒抗原检测试剂通过国家药品监督管理局注册审批，可能与抗原检测所需的抗体制备有关，也可能与抗原检测的临床效果有关。病毒特异性抗体需要通过使用抗原免疫动物制备，并筛选出适合用于抗原检测的抗体对，过程复杂，耗时较长，一定程度上导致了抗原检测试剂的研发比抗体检测试剂慢。本试剂盒与临床结果比较，灵敏度不足，不宜用于筛查。但据研究发现，部分确诊患者的呼吸道样本核酸检测阴性后，粪便中仍能检出新型冠状病毒核酸。若仅以呼吸道样本核酸检测阴性结果作为治愈标准，则可能会出现报道中的“复阳”现象，虽然“复阳”是否具有传染性尚无定论，但仍会给公众带来一定的恐慌。若将粪便核酸或抗原检测作为病人出院标准的补充，与呼吸道样本核酸检测一起，可降低潜在的粪口传播风险，为疫情防控增加一道防线。
致谢 感谢珠海市科技创新局“新型冠状病毒感染防治”应急科技攻关专项（ZH22046301200005PWC）的支持。
参考文献
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