闫书贵1，刘原2
（1.四川省苍溪县职业高级中学，邮编628400；2.四川苍溪猕猴桃研究所，邮编628400。）
摘要：猕猴桃防治溃疡病药剂与防治真菌性病害、防治虫害的药剂混合后，会增加药剂间的拮抗性，而降低药效。荧光假单胞杆菌单剂与不同类药剂配伍抑菌效果下降不明显，溃疡病防治药剂单剂配伍后抑制率下降幅度依次是：荧光假单胞杆菌＜四霉素＜中生菌素＜春雷·王铜，总体下降幅度呈现与螺虫乙酯配伍＜与杀真菌剂嘧霉胺配伍＜三类药剂配伍，中生菌素、春雷·王铜与嘧霉胺、螺虫乙酯三大类药剂配伍后完全无抑菌作用。
关键词：猕猴桃溃疡病；防治药剂拮抗性；室内研究
溃疡病是猕猴桃上最严重的细菌性病害，是猕猴桃生产中的毁灭性病害。该病的发生具有蔓延快、致病性强、防治难度大等特点，成为猕猴桃产业发展的主要限制因子之一。在防治中，果农为了省时省事，常将防治溃疡病的药剂与防治真菌性病害的药剂、防治虫害的药剂混合在一起，由于药剂的相互拮抗作用，降低了防治溃疡病药剂的有效性。为了摸清猕猴桃溃疡病防治药剂与其他病虫害防治药剂的拮抗性情况，并为田间药剂试验作准备，同时也为筛选科学组合的防治病虫害药物组合，达到更有效防治溃疡病之目的，课题组针对性开展了本试验。
1. 猕猴桃溃疡病菌的分离、纯化及分子鉴定
1.1供试病样
供试猕猴桃溃疡病样品于2019年4月6日采自四川省苍溪县中土镇板庙村猕猴桃园区，从当地主栽品种红阳上采集的感病叶片和枝条。
1.2供试培养基
LB固体培养基：10g氯化钠，10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10-15g琼脂粉，1000ml蒸馏水，pH在7.4左右。
1.3猕猴桃溃疡病菌分离与纯化
取有溃疡病的发病叶片和枝条，选择发病典型的病斑，用剪刀在病健结合部剪取长宽3-4mm的方形小块病组织数块，在无菌操作台上依次放入75%酒精中浸泡15s和0.1%升汞液中浸泡40s进行表面消毒，用无菌水连续漂洗3次，再用无菌滤纸吸取病组织上残留水分后放入灭菌离心管中用镊子捣烂，加入无菌水浸泡15min，用接种环蘸取浸泡液在LB固体培养基上进行划线，然后放入25℃人工智能气候箱内培养，待菌落长出后，取接近透明的单菌落进行PCR鉴定，鉴定为猕猴桃溃疡病菌的单菌落，通过划线法进一步纯化菌种，低温保存，作为试验菌株。
1.4供试病菌的分子鉴定
1)引物：根据Rees-George等[1]基于细菌16S-23S rDNA ITS内转录间隔区序列设计筛选的猕猴桃溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）特异性引物对PsaF1/PsaR2:
PsaF1: 5'-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3’
PsaR2: 5'-CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3’
由上海生工生物工程有限公司合成。
2）PCR扩增反应体系：取菌0.5μL作为模板，2×Taq mastermix 12.5μL，上下引物（10μM）各1μL，用无菌超纯水H2补足体积到25μL，混匀后进行PCR反应，无菌超纯水ddH照。
3）PCR扩增条件：94℃弱变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，72℃总延伸10min，12℃保存。
PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用1×TAE作为电泳缓冲液，上样量为5μL，恒压为100V，电泳分离25-30min后，在凝胶成像系统下成像并分析，预期产物为280bp。
1.5供试病原菌鉴定结果与分析
采集的4份材料分离的病原菌，通过特异性引物PsaF1/ PsaR2对分离菌种进行PCR扩增，产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约280bp的特异性片段（图1），片段大小与特异性引物设计大小相符合，鉴定为猕猴桃溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）。
图1 琼脂糖的电泳检测结果图
1.6供试病原菌鉴定结论与讨论
近年来，随着Pcr分子生物学技术的快速发展，被广泛应用于农业病虫害的检测，具有检测快速准确的优点。本试验利用Rees-George等[1]根据细菌16S-23S rDNA ITS内转录间隔区序列设计筛选的特异性引物，对分离得到的菌株进行PCR扩增、琼脂糖电泳检测，确定分离纯化的菌株为丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae），这与国内刘瑶等[2]对四川5地区猕猴桃溃疡病菌鉴定的报道一致，菌株用于后续试验研究。
2.猕猴桃溃疡病防治药剂拮抗性的室内试验
2.1供试药剂
课题组从苍溪猕猴桃溃疡病防治常用药剂中筛选出8种常用药剂，又根据猕猴桃溃疡病防治季节易发生的主要真菌性病害和虫病害发生规律，分别筛选常用杀真菌剂1种和杀虫剂1种，供试验药剂共10种。
表1 供试的10种药剂
2.2 供试菌株
猕猴桃溃疡病菌丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae, Psa），上述分离纯化保存的菌种。
2.3培养基
LB培养基：10g氯化钠，10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10-15g琼脂粉，1000ml蒸馏水，pH在7.4左右。
2.4试验方法
2.4.1菌悬液的配制
将上述分离纯化保存的菌株转到LB培养基上活化培养，将培养良好的病原菌用无菌水稀释，以无菌水调零，用紫外分光光度计在波长600nm处测菌悬液的吸光值，在0.3-0.4的范围内即可（OD600=0.3-0.4，细菌的浓度约为2*108CFU/ml[3]）。
2.4.2药剂对猕猴桃溃疡病菌的室内抑菌测定
本实验参照焦红红[4]滤纸片抑菌圈法并改进：在超净工作台上，将融化后冷却至60℃的固体LB培养基约25ml倒入直径9cm的培养皿内，用移液枪加入200μl上述配制好的菌悬液于培养基中，在培养基凝固之前迅速将二者充分摇匀制成带菌平板，每个平板放置直径6mm的灭菌滤纸片1-3个。将10种药剂按用药指导说明配成比生产使用浓度大10倍的溶液（表2），用移液枪取药液200ul依次加入到滤纸片上，以无菌水浸泡的滤纸片为对照，试验重复3次，25℃恒温培养中培养48h后，观察滤纸片周围有无明显的抑菌现象，用直尺测量抑菌圈直径，记录抑菌圈直径，计算抑制率。
抑制率（%）=（处理菌落直径-对照菌落直径）/处理菌落直径×100%
2.4.3药剂配伍对猕猴桃溃疡病菌的室内抑菌测定
将上述配制的8种溃疡病防治药剂分别与药剂A嘧霉胺按1:1配伍，与药剂B螺虫乙酯按1:1配伍，以及与药剂A+B按1:1:1配伍，按上述2.4.2方法进行抑菌试验。
表2 供试10种药剂产品的稀释浓度
2.5拮抗性试验结果与分析
2.5.1不同猕猴桃溃疡病防治单剂对猕猴桃溃疡病菌的抑制作用（表3）
从市面上销售筛选的8种猕猴桃溃疡病防治药剂中荧光假单胞杆菌的抑制效果最好，抑制率达84.21%，其余依次是四霉素、中生菌素、春雷·王铜，抑制率分别是77.78%、60%和40%，而春雷霉素、噻唑锌、氢氧化铜、噻菌铜几乎无抑制作用。
2.5.2不同类别药剂配伍对猕猴桃溃疡病菌的抑制作用（表3）
8种防治猕猴桃溃疡病的药剂分别与同时期筛选的2种猕猴桃其它主要病虫害防治药剂杀真菌剂嘧霉胺和杀虫剂螺虫乙酯进行两两配伍，以及三大类药剂配伍时，除了四霉素和螺虫乙酯配伍抑制效果增强，其余药剂配伍抑制效果均不如单剂的抑制效果，抑制率均有下降。其中，荧光假单胞杆菌单剂与不同类药剂配伍抑菌效果下降不显著，抑制率下降比列不超过6.7%；其次四霉素与嘧霉胺配伍抑制率下降8.16%，与螺虫乙酯配伍抑菌效果增强，但三大类药剂配伍抑制率大幅下降16.8%；铜制剂春雷·王铜与不同类药剂配伍抑菌效果下降最显著；溃疡病防治药剂单剂配伍后抑制率下降幅度依次是：荧光假单胞杆菌＜四霉素＜中生菌素＜春雷·王铜；总体下降幅度呈现与螺虫乙酯配伍＜与杀真菌剂嘧霉胺配伍＜三大类药剂配伍；中生菌素、春雷·王铜与嘧霉胺、螺虫乙酯三大类药剂配伍后完全无抑菌作用。
表3 8种药剂产品对猕猴桃溃疡病菌的抑制作用（抑菌圈直径与抑制率）
注：“－”号表示无。
图2 不同药剂及不同种类药剂配伍的抑菌图
2.6猕猴桃溃疡病防治药剂拮抗性试验结论与讨论
2.6.1生产上常用防治溃疡病药剂室内抑菌效果差
通过本次室内抑菌试验发现，春雷霉素、噻唑锌、氢氧化铜、噻菌铜等生产上常用溃疡病防治药剂的室内抑菌作用不明显，分析可能是由于连年使用这些药剂，造成溃疡病菌发生变异，或产生抗药性。目前化学预防是溃疡病防治的重要措施之一，因此筛选有效防治药物的研究至关重要。同时为了增强防治效果，建议一定要注意不同药剂的交叉施用。
2.6.2不同种类的药剂配伍会增加拮抗性，降低药效
在生产上我们通常为了节约劳动力和时间成本，果农常采用杀细菌剂+杀真菌剂+杀虫剂进行病虫害普防工作，目前还未见防治猕猴桃溃疡病药剂与杀真菌剂、杀虫剂配伍抑菌效果的室内研究，通过该实验我们发现猕猴桃溃疡病防治单剂与不同种类的药剂配伍，会显著增加药剂间的拮抗性，从而影响其对溃疡病菌的抑制作用。建议果农在防治溃疡病时将杀菌剂单独施用，尽量避免不同的药剂混合喷施降低药效；尤其是铜制剂作为碱性药剂不能与其它药剂混用。
参考文献
[1]Rees‐George J, Vanneste J, Cornish D, et al. Detection of Pseudomonas syringae pv. actinidiae using polymerase chain reaction (PCR) primers based on the 16S–23S rDNA intertranscribed spacer region and comparison with PCR primers based on other gene regions [J]. Plant Pathology, 2010, 59(3): 453-464.
[2]刘瑶, 朱天辉, 樊芳冰, 等. 四川猕猴桃溃疡病的发生与病原研究 [J]. 湖北农业科学, 2013, 52(20): 4937-4942.
[3]Di Lallo G, Evangelisti M, Mancuso F, et al. Isolation and partial characterization of bacteriophages infecting Pseudomonas syringae pv. actinidiae, causal agent of kiwifruit bacterial canker [J]. Journal of basic microbiology, 2014, 54(11): 1210-1221.
[4]焦红红. 猕猴桃细菌性溃疡病防治药物的筛选 [D]; 西北农林科技大学, 2014.