方安才，孙华林，田奎蓉，洪 业，刘俊林
(西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)
摘要：本试验通过乙醇提取和水提取玉米须多糖两种方法对高糖诱导糖尿病大鼠模型进行调节，结合血脂代谢情况分析其作用效果。将大鼠分为正常组、模型组和实验组(乙醇提取物、水提取物)，以健康大鼠作为正常组，试验各组按照剂量灌胃水提取玉米须多糖和乙醇提取玉米须多糖，治疗 4 周后，通过测定大鼠血浆中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)、甘油三脂(TG)、高密度胆固醇(HDL-C)、低密度胆固醇(LDL-C)、胆固醇(CHOL)和血糖(GLU)含量变化，分别对其改善糖尿病的效果进行综合分析。结果显示：两种提取玉米须多糖的方法都能有效降低血浆中的AngⅡ(P<0.01)含量，明显达到降低动脉血压的效果；由大鼠血脂代谢异常得到改善的数据分析糖尿病大鼠的治疗情况得知，数据表现出能极显著降低血清中 LDL-C、GLU、TG、ALD 与 CHOL 含量(P<0.01)，升高 HDL-C 水平(P<0.01)。总体来看水提取组降低 LDL-C、GLU、TG、ALD 与 CHOL 含量(P<0.05)、升高 HDL-C 水平(P<0.05)的能力明显强于醇提取组。
关键词：玉米须；糖尿病；血管紧张素Ⅱ；醛固酮；多糖
Two Extraction Methods of Zea Mays Polysaccharide to Ameliorate Metabolic Disturbance in Diabetic Rats
FANG An-cai，SUN Hua-lin，TIAN Kui-rong，HONG Ye，LIU Jun-lin
(College of Life Science and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030，China)
Abstract: In this experiment，two methods，ethanol extracted corn whiskers polysaccharide and water extracted polysaccharide，were used to regulate high glucose-induced diabetes mellitus in rats，and their effects were analyzed in the context of lipid metabolism. Each group of rats was divided into normal，model and experimental groups (ethanol extract and water extract)，with healthy rats as the normal group. The results showed that the two methods of extracting maize polysaccharide could effectively reduce the plasma levels of Ang II (P<0.01) and arterial blood pressure，and the results also showed that the two methods of extracting maize polysaccharide could effectively reduce the plasma levels of Ang II (P<0.01) and arterial blood pressure. The results showed that both methods of extracting maize whiskers polysaccharide could effectively reduce the plasma content of Ang II (P<0.01)，which significantly reduced arterial blood pressure. <0.01) and increased HDL-C levels (P<0.01). Overall speaking，the water extract group was significantly more effective than the alcohol extract group in reducing the content of LDL-C，GLU，TG，ALD and CHOL (P<0.05) and increasing the HDL-C level (P<0.05).
Key words：Zea mays；Diabetes mellitus；Angiotensin II；Aldosterone；Polysaccharide
Corresponding author：LIU Jun-lin，E-mail：ljl@xbmu.edu.cn
大量调查和研究均表明，血脂异常是一种全身性疾病，是导致动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病等多种疾病的主要因素[1]，而血脂异常带来的糖尿病通常伴随着血液中高密度胆固醇胆固醇(HDL-C)和低密度胆固醇(LDL-C)过低，胆固醇(CHOL)或甘油三酯(TG)过高[2]。而植物天然产物“玉米须(stigma maydis)”对机体副作用小，在《中药大辞典》、《滇南本草》等书籍中均有记载其调节改善的功效。但其使用剂量与效应关系并不明确，因此我们使用玉米须多糖治疗血脂异常引起的糖尿病，以求明确其剂量关系和比较两种不同方式提取的玉米须多糖的生物活性。
本试验通过复制糖尿病大鼠模型[3]，探讨玉米须中的多糖对糖尿病大鼠的血糖以及对HDL-C、LDL-C、CHOL、TG 的干预作用，对玉米副产物的综合开发利用提供理论基础和实践经验。因考虑到玉米须的实际临床用法和使用成本，我们使用最为常用的水提法和乙醇提法[4]，结合大鼠血清中的 ALD、AngⅡ 和 HDL-C、LDL-C、CHOL、TG 和 GLU 进行分析，来验证玉米须中的多糖对糖尿病大鼠的干预作用。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器 实验动物
试验动物：200~250gSD 大鼠 80 只雌雄各半，购于中国农业科学院兰州兽医研究所。(实验动物许可证号：SYXK(甘)2015-0001)。试验大鼠饲养、试验和处死均遵照实验动物管理条例和福利伦理指南执行。
玉米须：采自甘肃市榆中县，平均海拔 1700m 左右田间玉米须(stigma maydis)。
试剂：TG 试剂盒、HDL-C 试剂盒、LDL-C 试剂盒、CHOL 试剂盒，均购自自南京建成生物有限公司；碘[125Ⅰ]血管紧张素Ⅱ放射免疫分析药盒碘、[125Ⅰ]醛固酮放射免疫分析药盒，均购自北京北方生物技术研究有限公司；其余药品均为国产分析纯。
仪器：Beckman Coulter AU680 全自动生化分析仪，美国 Beckman公司；XH6020 全自动放射免疫计数仪，中国同辐股份有限公司；N-1100D 旋转蒸发器，上海安亭科学仪器厂；UV-1800紫外分光光度计，日本岛津；Biotek 多功能酶标仪，北京诺亚威仪器仪表有限公司；FD-1C-50真空冷冻干燥仪，北京博医康实验仪器有限公司；3K30 超速低温离心机，Sigma公司；85-2数显恒温磁力搅拌器，上海梅香仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 玉米须多糖的醇提取 将玉米须洗净后切碎置于 80℃ 恒温干燥箱中干燥至恒重，充分研磨粉碎，70℃、70% 乙醇浸提 2h ，60 目筛过滤后收集滤液，重复三次，合并样液，转入真空冷冻干燥器(–60℃)，干燥至恒重，得到玉米须醇提取物[5]，实验时，蒸馏水溶解配制。
1.2.2 玉米须多糖的水提取 取干燥玉米须粉碎，精确称取 200 g，用 1.5 L 蒸馏水于 50℃水浴振荡器中提取两遍，共 3 h，尼龙布过滤收集滤液；将滤液离心取其上清液，于 80℃ 水浴锅中浓缩至小体积后，将小体积溶液用真空干燥器继续干燥，直至水分完全蒸发，即得玉米须水提取物[6]。
1.2.3 玉米须多糖含量测定 采用苯酚 - 硫酸法[7-8]进行测定，于 490 nm，以试剂空白为参比测定吸光度。以纵坐标 y 为吸收峰，横坐标 x 为浓度建立回归方程得 Y=0.085X-0.015 7，R2=0.9983。根据提取率公式计算多糖的提取率：
式中：C 为由回归方程计算所得多糖含量(mg)；D 为稀释倍数；F 为玉米须多糖相对葡萄糖的换算因子，值为 2.365；M 为所需玉米须的质量(mg)。
1.2.4 糖尿病大鼠模型的建立及治疗过程
1.2.4.1 糖尿病大鼠模型的建立 选取 12 周龄大鼠，我们使用吴栩等人[9]筛选和优化出的建立大鼠模型的方法，并结合自身实验条件加以修改建立了糖尿病大鼠模型：基础饲料 60.8g + 猪油 15g + 蛋黄粉 10g + 蔗糖 10g + 胆固醇 2g + 胆酸钠 2g + 丙基硫氧嘧啶 0.2g，并在喂饲高脂饲料前一次性腹腔注射 600000U/kg 维生素D3，能较好的建立起糖尿病大鼠模型[10-11]。
1.2.4.2 分组及治疗过程模型建立 取64只建模成功大鼠均分为8组，每组8只。分为玉米须水提取高剂量组(水玉高)、玉米须水提取中剂量组(水玉中)、玉米须水提取低剂量剂量组(水玉低)、玉米须醇提取高剂量组(乙玉高)、玉米须醇提取中剂量组(乙玉中)、玉米须醇提取低剂量组(乙玉低)，进行灌胃给药。以健康大鼠作为正常组，模型组与空白组给予等量正常饮用水，取 1.2.1 中提取所得醇提取物和水提取物对实验组以一定浓度梯度(低剂量组 1.0mg/mL、中剂量组 4.0mg/mL，高剂量组 8.0mg/mL)，灌胃体积为 20mL/kg，给予糖尿病大鼠持续灌胃治疗4周。
1.2.5 大鼠血清中 ALD、AngⅡ 含量变化测定 治疗结束后，皮下注射戊巴比妥麻醉固定，颈侧动脉采血，2500r/min，4℃ 离心 10min 后吸取血清，按照各试剂盒要求测定血清中 AngⅡ、ALD 的含量及 GLU 的值。
1.2.6 大鼠血浆中 TG、HDL-C、LDL-C、CHOL 的含量测定 采用颈侧动脉采血方法分别取各组大鼠静脉血，按照 TG、HDL-C、LDL-C、CHOL 试剂盒流程，进行含量测定。
1.3 数据处理
平行测定三次，取平均值，所绘制的数据表中数据表示为(x±s)的形式，使用 spss 23.0 软件对测定结果采用 T 值法进行统计学检验分析。
2 结果
2.1 玉米须不同提取方式提取物对大鼠血浆中 CHOL 和 GLU 的含量变化影响 如表 1可知，模型组 CHOL 和空腹 GLU 含量与正常组相比差异极显著(P<0.01)；其中水玉中、高组 CHOL、空腹 GLU 含量与模型组相比具有极显著性差异(P<0.01)，水玉低组和乙玉中、高组 CHOL、空腹 GLU 含量与模型组相比都有显著性差异(P<0.05)。
表1 大鼠血浆中 CHOL、GLU 含量(x±s)
Table 1 Contents of CHOL and GLU in rat Plasma(x±s)
*与模型组相比具有显著性差异(P<0.05)；**与模型组相比具有极显著性差异(P<0.01)，下表同。
* compared with the model group，there was significant difference (P<0.05)；* compared with the model group，there was a very significant difference (P<0.01)，The following table with.
2.2 玉米须不同提取方式提取物对大鼠血浆中 ALD 和 A ngⅡ 的含量变化影响 如表 2可知，模型组 ALD 和 AngⅡ 与正常组相比有差异极显著(P<0.01)，水玉高、中、低组大鼠血清中 ALD、AngⅡ 含量与模型组相比具有极显著性降低(P<0.01)，乙玉高、中、低组 ALD、AngⅡ 含量与模型组相比具有显著性降低(P<0.05)。
表2大鼠血浆中 ALD 与 AngII 含量(x±s)
Table 2 Contents of ALD and AngII in rat Plasma(x±s)
2.3 玉米须不同提取方式提取物对大鼠血浆中 TG、HDL-C、LDL-C 的含量变化影响 如表3可知，模型组大鼠血浆中 HDL-C、LDL-C 与 TG 含量与正常组相比差异极显著 (P<0.01)，大鼠表现出血脂异常的症状；水玉高、中、低组大鼠血浆中 HDL-C、LDL-C 与 TG 含量与模型组相比有极显著增高(P<0.01)；乙玉高、中、低组大鼠血浆中 HDL-C、LDL-C 与 TG 含量与模型组相比显著性增高(P<0.05)。
表3大鼠血浆中 TG、HDL-C、LDL-C 的含量(x±s)
Table 3 Contents of HDL-C，LDL-C，and TG in rat Plasma(x±s)
3 讨论
现随着生活水平日益提高，人们的饮食结构向高脂、高糖和高热方向发展，造成机体营养代谢过剩，从而导致许多疾病的发生，其中由血脂异常引起的糖尿病已经成为严重危害人类健康的重要疾病之一[12]，本试验采用高糖饲料饮水饲喂大鼠建立糖尿病大鼠模型，结合大鼠血清中的 ALD、AngⅡ 和 HDL-C、LDL-C、CHOL、TG 和 GLU 进行分析，来验证玉米须中的多糖对糖尿病大鼠的干预作用。试验结果显示：玉米须多糖的两种提取方法都能有效降低血浆中的 AngⅡ(P<0.01)含量，改善大鼠代谢紊乱的情况，且治疗作用效果因剂量有所差异，表现为都能有效降低 LDL-C、GLU、TG、ALD 与 CHOL 含量(P<0.01)，升高 HDL-C 水平(P<0.01)。且综合分析可知水提取法比醇提取法对大鼠糖尿病有更好的改善作用，其中以水提取法提取的玉米须多糖治疗效果最为显著。
人们由于长期摄入高糖高脂类物质而引发机体脂质和水盐代谢紊乱，使得AngⅠ 向 AngⅡ 快速转化，导致血浆 Ang II 水平显著升高[13-14]，而 AngⅡ 具有很强收缩血管的能力，能使全身小动脉收缩而升高血压[15]，研究表明 ALD 的分泌受到 AngⅡ 的调节，AngⅡ 会刺激生成 ALD，而醛固酮进一步升高会对靶器官有损害[16]，所以从本试验来看适当服用玉米须能防止醛固酮浓度过高，达到降低靶器官损害和降低血压的作用，有利于维持人体水盐平衡。研究发现 HDL 主要负责把胆固醇从肝脏运送到全身外周组织细胞，是血液中胆固醇的主要载体蛋白[17]，所以如果 HDL 过低也会导致外周组织细胞的胆固醇含量升高；刘瑾等人的研究表明[18] TG、LDL-C、CHOL 的水平升高，会引起糖尿病、动脉粥样硬化、冠状动脉硬化引起的冠心病等，最终导致高血脂合并高血压，造成机体器官负担过重。由上可知，使用两种方法提取玉米须多糖，两种提取方式提取的玉米须多糖均具有升高大鼠血浆中 HDL-C 含量，降低血清中 TG、LDL-C、CHOL 含量的效用，但水提取组明显优于醇提取组，是因为水提取组降低 LDL-C、GLU、TG、ALD 与 CHOL 含量(P<0.05)、升高 HDL-C 水平(P<0.05)的能力明显强于醇提取组，但这其中的具体发生机制目前尚未研究清楚，这可以作为未来工作者们研究的方向。所以降低血浆 AngⅡ 水平，改善血脂代谢紊乱，是治疗血脂异常引起的糖尿病的关键因素。同时研究大量发现玉米须提取物中活性物质含量颇丰，其相关生物活性机制具有较高潜在研究价值[19]，本试验为天然产物的开放和利用提供了依据，以期对玉米须的开发更加深入。
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[收稿日期：2019-12-30
项目基金：国家级大学生创新创业训练计划项目(201910742088)；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(XBMU-BYL19097)
作者简介：方安才(1998-)，男，本科生，就读于生物工程专业
通讯作者：刘俊林