晁玉凡1*，通讯作者高松燕2#
1.上海大学医学院，上海 200444
2.上海大学转化医学研究院，上海 200444
[摘要] 目的：系统研究结晶肾损伤小鼠血液中代谢物的变化，以揭示草酸钙结晶形成中代谢异常机制。方法：将18只C57B/L6雄鼠随机分为正常组、乙醛酸盐一天组、乙醛酸盐五天组，采用基于超高效液相-四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF/MS）的代谢组学方法测定血清代谢物的变化，结合 SIMCA-P进行差异代谢物筛选。结果：与正常组小鼠相比，模型组小鼠的肾组织出现明显的钙盐沉积；从血清中筛选出肌醇、脯氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、马尿酸、尿酸等45个差异代谢物。结论：差异代谢物主要涉及中长链脂肪酸代谢、长链脂肪酰卡尼丁代谢、氨基酸代谢和牛磺酸代谢，以揭示疾病的代谢异常机制。
[关键词] 代谢组学；草酸钙结晶；超高效液相-串联质谱
一、前言
肾结石是泌尿系统最常见的疾病之一，其常见临床症状有腰部绞痛、腹胀、血尿以及尿路感染等，病程较长且易反复，在首次发病后，有50%的可能会在7年内再次发病[1]。目前的治疗方法多具有出血、疼痛、发热、肾小管坏死等副作用[2]。因此，加强对泌尿系结石形成机制的研究，从根源上预防和治疗泌尿系结石是十分必要的。近年来，随着流行病学的不断发展，研究者发现机体代谢紊乱在结石的形成过程中发挥着重要的作用[3]。
代谢组学可以对反映生物体状态变化的内源性代谢物进行全面的监测和研究[4]，因此，我们可以采用代谢组学方法研究草酸钙结晶引起的肾损伤的系统性代谢变化。本实验使用乙醛酸盐诱导的小鼠草酸钙结晶模型，以基于高效液相色谱高分辨质谱联用仪平台的代谢组学方法为主要研究手段，对草酸钙结晶小鼠血清中内源性代谢物的变化进行系统研究，以揭示疾病的代谢异常机制。
二、实验部分
1.试剂
甲醇和乙腈购买于默克公司(Darmstadt, Germany)。甲酸购买于Fluka (Buchs, Switzerland) 。乙醛酸购于TCI （Tokyo, Japan）。
2.动物实验与样本采集
18只七到八周龄C57B/L6雄鼠购买于上海斯莱克斯实验动物有限公司。经过一周的适应性饲养，随机分为三组，对照组，乙醛酸盐一天组和乙醛酸盐五天组。模型组每天腹腔注射100mg/kg的乙醛酸盐，一天组注射一天，五天组连续注射五天。最后一次注射后，眼眶取血，室温静置1小时后，4000rpm，4°C离心5min，取上层血清置于-80℃保存。行心脏灌流后，采集肾脏，置于4%多聚甲醛中固定。
3.动物模型评价
将固定后的肾组织用石蜡包埋，切成3-4μm的薄片进行冯库萨（von Kossa）染色。在400倍放大倍数下，观察肾组织钙沉积情况。
4.样品前处理与代谢组学分析
取100μl血清加入300μl甲醇，涡旋5min，13000rpm，4°C离心15min，取上清。1290 Infinity 液相系统和安捷伦6530 高分辨四级杆-飞行时间串联质谱联用仪 (Agilent, USA) 用于血清代谢组学分析。色谱分离使用ACQUITY UPLC HSS T3 柱（2.1mm× 100 mm, 1.8 μm, Waters, Milford, MA)，柱温40°C。流动相为0.1%的甲酸（A），0.1%甲酸的乙腈溶液（B）。梯度条件：0-2min, 5%B; 2-17min, 5%-95%B; 17-19min; 95%B。流速0.4ml/min，进样量3μl。质谱使用正、负离子模型。MS/MS分析碰撞能量：10-40eV.
5.数据处理及统计学分析
使用R软件的 XCMS程序包，进行峰识别，校正和积分。根据80%原则筛选去除噪音信号，用平均值进行缺失值补充。归一化处理后，导入到SIMCA-P 11.0 (Umetrics, Umea, Sweden)，进行多元统计分析。采用无监督的主成分分析（PCA）来表征组间的分离趋势。采用有监督的偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）进行差异物质的筛选，VIP值越大的离子表明对组间差异的贡献率越大[5]。将VIP值大于1的变量作为显著差异物质的候选变量。
使用单因素的方差分析及Tukey’s post hoc test对多组间的显著性进行检验。 p<0.05认为在统计学上有显著性差异。
三、结果与讨论
1.模型评价
Von Kossa染色显示，正常小鼠肾脏中未出现钙沉积情况，乙醛酸盐一天组出现少量的钙沉积，五天组则出现明显的钙沉积情况，表明模型构建成功。
2.血清代谢组学轮廓分析
三组样品的PCA分析显示对照组（S0）、乙醛酸盐一天（S1）组和乙醛酸盐五天（S5）组分离良好。采用PLS-DA模型分别研究S1组和S5组与S0的差异情况。如图1所示，S1-S0组与S5-S0组均显著分离。排列测试分析表明模型均良好，未出现过拟合现象。对VIP值大于1，FC大于2的离子进行方差分析以及两两比较，p<0.05的离子则为血清中显著差异的离子。根据一级精确质荷比以及二级碎片离子与Metlin(http://metlin.scripps.edu/)数据库进行比对，进行代谢物的鉴定。共鉴别出45个差异代谢物。其中有26种中长链脂肪酸和长链脂肪酰卡尼丁，在S1组和S5组均显著上升，而卡尼丁和一种短链脂肪酰卡尼丁，丙酰卡尼丁的量显著下降；另外，肌醇，脯氨酸，蛋氨酸，苏氨酸，酪氨酸，脯氨酸甜菜碱，次黄嘌呤，黄嘌呤，肌苷，马尿酸，油酸酰胺在模型组显著下降，而尿酸，三种脂肪酰甘氨酸，胆酸，2-氧代戊酸则显著上升。除中长链脂肪酸和长链脂肪酰卡尼丁外的代谢物见表1。
图1. 血清正离子模式下S0，S1组与S0，S5组PLS-DA分析，（A）S0-S1组得分图，（B）S0-S5组得分图，（C）S0-S1组S图，（D）S0-S5组S图。
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3.讨论
本研究中，我们根据Okada等人[6]的方法成功建立了乙醛酸盐诱导的小鼠结晶肾损伤模型。使用液质联用平台对小鼠血清进行代谢组学轮廓分析，共筛选出45种显著差异的代谢物。主要涉及中长链脂肪酸代谢，长链脂肪酰卡尼丁代谢，氨基酸代谢，牛磺酸代谢，嘌呤代谢等。
模型组血液中卡尼丁，大量脂肪酰卡尼丁的含量发生了显著变化，其中卡尼丁是运输活化的长链脂肪酸进入线粒体基质内，进行?氧化并提供能量的一种必需的辅助因子[7]。有报道称可以通过补充丙酰-L-卡尼丁（Propionyl-L-carnitine，PLC) 来减缓化学物质诱导的肾损伤以及肾移植后缺血再灌注造成的肾损伤[8]，发挥作用的原因不仅为可以增加卡尼丁的含量，增加能量的供应，并且可以降低脂质过氧化和自由基的产生。而大量报道表明活性氧簇（ROS）的累积与肾小管细胞的损伤以及钙盐的附着有重要的关系[9]。在我们的研究中，血液中卡尼丁和PLC的含量显著下降，多种脂酰卡尼丁的含量则显著上升，大量中长链脂肪酸堆积，表明线粒体中?氧化功能显著被抑制[10]。
次黄嘌呤、黄嘌呤及尿酸都是嘌呤代谢中的重要物质。在模型组血液中，肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、尿酸均发生显著变化，肌苷，黄嘌呤，次黄嘌呤显著下降，尿酸显著上升，说明在此模型结晶形成过程中嘌呤代谢产生显著异常。而嘌呤代谢在人体内和小鼠体内的代谢情况存在一定的差异，小鼠体内，尿酸在尿酸酶的作用下，可以进一步转化成尿囊素；而人体内因缺乏尿酸酶，尿酸通常被认为是嘌呤代谢的终产物[11]。因此，可能还需要结合临床样本来验证嘌呤代谢的影响。
参考文献
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