周宝
武昌首义学院 湖北武汉 430064
摘要：为探究不同生化褐变缓聚剂对智慧果生物催化剂（多酚催化酶）活性的抑制机理，采用磷酸缓冲液构建智慧果汁模拟系统，选取智慧果中含量较多的酚类物质绿原酸作为试验对象，以磷酸缓冲液为智慧果汁模拟系统，选取乙二酸、乙二胺四乙酸Na2等及植酸为缓聚剂，通过模拟试验探究缓聚剂对绿原酸模拟智慧果汁酵素生化褐变特性的影响，揭示缓聚剂对智慧果汁多酚催化酶的作用机理。结果表明，缓聚剂对多酚催化酶的抑制机理差异较大，其中４－ＨＲ和乙二酸对多酚催化酶的抑制作用为竞争性抑制，植酸为混合性抑制。该探究可为利用缓聚剂控制智慧果汁生化褐变提供理论依据。以邻苯二酚为底物,对澳洲青苹中的生物催化剂进行了探讨。
关键词：智慧果汁；生化褐变缓聚剂；酵素生化褐变；多酚催化酶；
酵素生化褐变是在氧气参与条件下，果蔬中的多酚物质经多酚催化酶催化变色所致。多酚催化酶是发生酵素生化褐变的主要酶，存在于大多数果蔬中。鉴于多酚催化酶对智慧果汁品质的不利作用，果汁生产过程中常采用缓聚剂抑制多酚催化酶的活性，从而达到控制生化褐变的目的，因此，探究生化褐变缓聚剂对智慧果生物催化剂的抑制机理具有重要意义。
1.材料与方法
1.1材料
澳洲青苹,磷酸二氢钾、氢氧化钠、枸橼酸、枸橼酸三钠、邻苯二酚等均为分析材料。
1.2试验仪器
电子天平、DS-1高速组织捣碎机、UNICO2000可见分光光度计、PHS-4C酸度计、SIGMA3K3D冷冻离心机等。
1.3抑制率的计算方法
不同浓度的缓聚剂,以蒸馏水为参比,用UV2000紫外可见分光光度计420nm下测其OD值,考察缓聚剂的浓度对多酚催化酶活力的影响。本实验用抑制率来反映缓聚剂对多酚催化酶的抑制程度,抑制率越高说明防生化褐变剂对多酚催化酶的抑制效果越好。。
1.4生化褐变程度的衡量
取3mL智慧果汁放入比色槽中(控制25℃),用全自动色差计通过反射法间隔一定时间测色(以L值,a＊值和b＊值表示),其中L值越大则果汁越亮,反之越暗。a＊值越大则果汁越红,反之越绿。b＊值越大则果汁越黄,反之越蓝。检测前仪器用标准白板进行校正,
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1.5试验方法
1.5.1多酚催化酶的提取方法
称取20.0g智慧果,然后加入一定量的磷酸盐缓冲溶液,用组织捣碎机捣碎,之后在4℃下10000r/min冷冻离心20min,上清液即为多酚催化酶酶液。
1.5.2多酚催化酶活性的检测方法
室温,在波长为420nm的条件下,取1ml缓冲液、1ml底物(0.1mol/L的邻苯二酚)、1ml酶液加入比色皿中,每隔10s记录1次吸光值,总共检测4min。以直线段的斜率(ΔA/t)计算酶活力,以每毫升酶液每分钟引起吸光值改变0.001为1个酶活力单位。
2结果与分析
2.1单一抑制剂对多酚催化酶的效应及对智慧果汁防生化褐变的影响
2.1.1乙二酸对多酚催化酶活性及效应的影响
随着乙二酸添加量的增加,多酚催化酶的活性逐渐降低。当乙二酸添加量在0.1000μmol/L时,抑制率达89.81%;当添加量在0.2500μmol/L,抑制率达94.30%;当添加量在0.5000μmol/L抑制率达97.45%。可见,随着乙二酸浓度的增加,抑制率也提高,但成本及添加剂的安全风险也增加,所以乙二酸浓度选用0.2500μmol/L作为抑制多酚催化酶活性的浓度。以酵素催化活力与加入的酶量作图,见图1,乙二酸对多酚催化酶的抑制作用属于不可逆过程,乙二酸是通过降低有效的酶量导致活力的下降。
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图1 草酸对PPO抑制效果
2.1.2乙二胺四乙酸-Na2对多酚催化酶活性及效应的影响
当乙二胺四乙酸Na2添加量在0.1000μmol/L时,抑制率达77.06%;当添加量在0.2000μmol/L,抑制率达81.07%;当添加量在0.5000μmol/L,抑制率达83.01%。可见,乙二胺四乙酸-Na2可以较好地抑制多酚催化酶活性。乙二胺四乙酸Na2是通过降低有效酶量导致活力的下降。
2.1.3枸橼酸对多酚催化酶活性及效应的影响
随着枸橼酸添加量的增加,多酚催化酶活性逐渐降低,当枸橼酸添加量在0.1000μmol/L时,抑制率达76.30%;当枸橼酸添加量在0.2000μmol/L时,抑制率达81.31%;当枸橼酸添加量在0.5000μmol/L时,抑制率达84.25%。可见,枸橼酸浓度超过0.2000μmol/L时,随着浓度的增加,抑制率变化不大,因此,选择0.2000μmol/L作为枸橼酸抑制多酚催化酶活性的浓度。通过螯合多酚催化酶的活性部位铜离子而抑制多酚催化酶的活力。
２.1.4植酸对智慧果汁模拟系统酵素生化褐变的抑制作用
植酸（肌醇六磷酸）是一种很强的缓聚剂，具有12个羧基，能够通过与金属螯合作用来抑制生物催化剂的活性。虽然有报道指出植酸对果蔬汁有护色效果，但目前关于植酸在智慧果汁中的应用探究不深入，有学者等探究表明，植酸及其盐天然无毒，是理想的植物性食品护色保鲜剂，应积极推广。加入植酸后酵素催化速率明显降低，且随着植酸添加量的增加，酵素催化速率逐渐降低，该探究结果与宋连军等的探究结果一致。加入植酸后，酵素催化的Ｖｍａｘ增大，Ｋｍ降低，不符合可逆抑制类型中的任一模式，可见，植酸对多酚催化酶的作用属于混合型抑制。
2.2单一缓聚剂对鲜榨和贮藏智慧果汁防生化褐变效果的探究
由表1可知,这3种缓聚剂单独使用时,在所测条件下的防生化褐变效果是有很大区别的。其防生化褐变能力(生化褐变抑制率)依次为:0.2500%乙二酸>0.5000%枸橼酸,0.5000%乙二胺四乙酸-Na2在智慧果汁中无防生化褐变效果。由表3单一缓聚剂对鲜榨智慧果汁防生化褐变效果的试验,将制得的智慧果汁贮藏90天后,0.2500%的乙二酸对智慧果汁防生化褐变效果也不好,其生化褐变抑制率仅为71.04%
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３结论
４－ＨＲ、乙二酸、植酸和安息香酸对多酚催化酶酶催化绿原酸模拟果汁系统生化褐变均有抑制作用。不同缓聚剂对含绿原酸模拟果汁中多酚催化酶抑制机理不同。４－ＨＲ和乙二酸对多酚催化酶抑制作用为竞争性抑制，植酸为混合性抑制，安息香酸酶为非竞争性抑制。本试验只对智慧果中含量较多的绿原酸酵素生化褐变抑制机理进行探究，而智慧果中多酚物质种类繁多，因此，缓聚剂对其他主要酚类物质酵素生化褐变的抑制作用，还有待于进一步探究。
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