艾斯卡尔·吾斯曼1 阿米娜·毛依冬2
1.新疆阿克苏地区温宿县畜禽品种改良站 843100 2.新疆阿克苏地区温宿县畜牧兽医站843100
摘要：用分离X和Y精子的性控精液进行人工授精是控制家畜性别之最简单可行的方法。 然而，低密度性控精液输精效果还不如常规人工授精，许多技术环节都有待改进。以常规冻精和稀释常规冻精为对照，研究解冻方法、输精时间和部位、不同精液来源和输精员以及育成和经产牛等因素对性控冻精人工授精妊娠率的影响。结果显示, 精液解冻水浴温度和持续时间对人工授精效果有显著影响，性控精液对解冻水浴温度更敏感；性控冻精和稀释常规冻精比常规冻精对输精时间要求更严格；3种精液输精到排卵卵泡同侧子宫角基部受胎率都显著高于输精于子宫体和同侧子宫角前端；3种精液育成牛受胎率(80%)都显著高于经产牛(50 %)；于输精同时注射促排卵素3号明显提高性控冻精受胎率；经严格挑选、能够从事胚胎移植操作的技术熟练输精员之间性控冻精受胎率差异不显著；在所设计的不同条件下，性控冻精与稀释同样倍数的常规冻精行为相似，说明精子分离过程没有对精子造成特殊损伤。 研究结果说明，精确控制人工授精各个技术环节可以实现消除性控与非性控、低密度与高密度精液之间的差别，获得高妊娠率。
关键词:性控精液；人工授精；影响因素；奶牛
1 材料与方法
1.1受配奶牛
2015-2018年分别在试验基地进行奶牛性控冻精的应用研究。试验中受配奶牛除特别说明外均为大于16月龄、体况良好和发情周期正常的育成牛。
1.2 精液
性控冻精为流式细胞分离仪分离后冷冻保存的X精子。性控冻精的规格为 0.25 mL/支，每支含2 ×106个精子, 活力≥0.3，X 精子含量≥90 %。试验中应用的常规冻精规格为0.25 mL/支、每支含10×10 6个精子,活力≥0.30。稀释常规冻精为常规冻精解冻后用PBS稀释，再装入细管，规格为0.25 mL/支、每支2×106个精子。
1.3 精液解冻
从液氮罐中取出冻精细管，立即根据试验设计要求置于不同温度水浴不同时间解冻。自水浴取出后的细管，擦干后剪去一端。取1滴精液滴于载玻片上，盖上盖玻片镜检，活力≥0.3的装入输精枪中，准备授精。
1.4 输精
5个试验牛场各选出1名技术熟练、经验丰富的人工授精员, 进行严格技术培训后实施人工授精操作。各试验牛场在试验期间特别加强对受配奶牛的发情观察, 只有静立接受爬跨的奶牛才判断为发情。输精前对发情奶牛进行直肠检查，有排卵前大卵泡者进行人工授精。根据试验安排，授精的部位分别为子宫体、子宫角基部或子宫角前端。除非特别说明，输精剂量均为1支细管/头牛。
1.5 妊娠诊断
输精后60-90 d，对奶牛进行直肠检查，确定妊娠率。
1 .6 数据分析
试验至少重复3次。数据用SPSS 11.5统计软件的ANOVA 模块进行单因素方差分析。在进行ANOVA分析之前，百分数要进行反正弦转换。数据均以x ±s表示，P<0认为差异显著
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2 .2 性控精液输精时间对对妊娠率的影响
冻精于39 ℃水浴10 s解冻。受配牛静立接受爬跨后不同时间进行子宫角基部输精。结果显示，常规冻精10～11h和12～14 h输精受胎率差异不显著, 但 16～18 h输精妊娠率显著下降。而性控精液和稀释常规精液则只有12～14 h输精的受胎率很高，其他2个时间点妊娠率都显著下降(表3)。说明低密度精子输精对输精时间要求更严格。
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2 .4 不同牛场(输精员)性控冻精输精效果比较
对5个输精员分别在各自实验牛场采用相同方法和条件进行性控冻精输精的结果进行了统计分析。性控冻精39 ℃水浴10 s解冻。发情牛静立接受爬跨后 12～14 h输精于子宫角基部。结果显示，5个输精员获得的受胎率都在80 %以上，且没有显著差异(表5)。说明只要控制好解冻和输精方法等条件，技术熟练的输精员都能获得好的结果。
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3 讨论
常规冻精的人工授精实践证明，冷冻精液的解冻速率对精子的活力有显著影响，而采取什么解冻速率往往受冻精时采用的冷冻保护剂、甘油浓度、包装方法及冷冻速率等因素决定。研究结果表明，对于常规冻精和稀释常规冻精，38、39 或40 ℃，10 s解冻效果要好于37 ℃, 10 s,而对于性控冻精39 ℃或40℃, 10 s要好于38 ℃和37 ℃, 10 s。说明性控冻精对解冻速度要求更严格 ,速度应该更快些。我们还发现，在 39 ℃水浴中停留过长时间(30 s)对精子不利。试验结果显示，常规冻精10～11 h和12～14 h输精受胎率差异不显著，但16～18 h输精妊娠率显著下降。而性控精液和稀释常规精液则只有12～14 h输精的受胎率很高，其他2个时间点妊娠率都显著下降。有研究表明，牛常规人工授精获得最高受胎率的输精时间是在发情开始后6～18 h。这说明低密度精子人工授精对输精时间要求更严格。另外，本研究证明促排卵素3号处理提高了3种精液输精的妊娠率。因此 ,我们于母牛发情后12～14 h注射促排卵素3号正好促进了体内LH高峰的出现，使排卵前卵泡及时排卵受精。本研究中，3种精液都是输精于排卵卵泡同侧子宫角基部妊娠率显著高于输精于子宫体和子宫角前端。输精于子宫体的精液无疑会降低有效精子密度，因为有一部分精子可能要迁移到非排卵侧输卵管。
本试验中用3种精液分别对育成母牛和经产母牛进行子宫角基部输精结果显示，经产牛的受胎率只有50 %多，而育成牛的受胎率则高达80%以上。据报道，在饲养管理条件(营养、疾病控制、发情鉴定，精液处理及输精技术)十分优化的情况下, 育成牛的受胎率一般都高于泌乳母牛。试验反复证明，在管理条件好时，育成牛用低密度性控精液输精的妊娠率与用常规精液输精几乎相当。然而，如果管理较差，性控精液的受胎率则往往很低；经发情同步处理、按约定时间输精，而不是见到允许爬跨再输精时，育成牛的受胎率也很低[1]。然而，如果通过超声波检查和查记录等方法选择生殖机能完全正常的经产奶牛进行性控精液输精 ,妊娠率则可能达到育成牛的水平。
总之 ,我们以常规冻精和稀释常规冻精为对照，研究了解冻方法、输精时间和部位、不同精液来源和输精员以及育成和经产牛等因素对性控冻精人工授精妊娠率的影响。结果显示, 精液解冻水浴温度和持续时间对人工授精效果有显著影响，性控精液对解冻水浴温度更敏感；性控冻精和稀释常规冻精比常规冻精对输精时间要求更严格；3种精液输精到排卵卵泡同侧子宫角基部受胎率都显著高于输精于子宫体和同侧子宫角前端；3种精液育成牛受胎率都显著高于经产牛；于输精同时注射促排卵素3号明显提高性控冻精受胎率；经严格挑选、能够从事胚 胎移植操作的技术熟练输精员性控冻精受胎率差异不显著;在所设计的不同条件下，性控冻精与稀释同样倍数的常规冻精行为相似，说明精子分离过程没有对精子造成特殊损伤。这些研究结果说明, 精确控制人工授精各个技术环节可以实现消除性控与非性控、低密度与高密度精液之间的差别，获得高妊娠率。
参考文献
[1] 王建勇, 潘远达, 吴谢华, 等.影响奶牛性控冻精情期受胎率的因素分析[J]. 中国乳业, 2015, (160): 48-51.