双氢睾酮通过RhoA/ROCK信号通路介导的JNK磷酸化调节内皮祖细胞迁移能力--中国期刊网

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双氢睾酮通过RhoA/ROCK信号通路介导的JNK磷酸化调节内皮祖细胞迁移能力

发表时间：2021/1/19 来源：《医师在线》2020年8月15期作者：徐颖佳1 朱振华1 吴春城1 任国庆2 孙文文2

[导读] 探讨双氢睾酮（DHT）对内皮祖细胞（EPCs）迁移能力的影响及其机制

徐颖佳1 朱振华1 吴春城1 任国庆2 孙文文2
1.吴江区第五人民医院内科，江苏苏州215200
2. 江苏大学附属医院急诊科，江苏镇江 212001
[摘要] 目的: 探讨双氢睾酮（DHT）对内皮祖细胞（EPCs）迁移能力的影响及其机制。方法: 采集脐带血，分离出EPCs并进行体外培养。随机分为对照组和DHT组（接受10 nmol/L的DHT干预），采用Transwell法评估EPCs迁移能力；Western bloting检测信号蛋白含量变化；免疫共沉淀法检测信号蛋白磷酸化水平。结果: 与对照组相比，DHT能显著提高EPCs的迁移率；增加RhoA含量；提高ROCK分子的磷酸化水平。结论: DHT能够增强EPCs的迁移能力，其机制主要涉及RhoA/ROCK信号通路介导的JNK蛋白磷酸化。
[关键词] 双氢睾酮；内皮祖细胞；迁移；RhoA/ROCK；JNK
　　内皮祖细胞（EPCs）是一类能够自我更新和增殖分化的定向干细胞群，在血管内皮修复和新生的过程中扮演重要的作用[1]。雄激素能够调控EPCs的功能，促进缺机体血管新生和修复[2]。RhoA/Rho激酶( ROCK)信号通路参与调控血管内皮修复及血管新生。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是RhoA/ ROCK信号通路的重要下游信号分子，在EPCs的增殖、分化和迁移的过程中扮演重要作用。JNK信号通路是研究较为广泛的一种MAPK信号通路。
1. 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
　　双氢睾酮(DHT)购自美国Sigma公司。淋巴细胞分离液购自美国Amersham Biosciences公司。Transwell小室购自美国Millipore公司。胰蛋白酶购自美国Gibico公司。
1.2 EPCs细胞的分离及培养
　　本研究获得医院伦理委员会同意，在产妇及其家人知情同意的情况下采集其婴儿脐带血，采用乙二胺四乙酸抗凝。随后按照3:1比例加入3%明胶，室温静止20min后1000r/min离心10min，弃上清留取沉渣；加入淋巴细胞分离液梯度离心得到单个核细胞，并进行重悬。
　　将所得到的单个核细胞接种至纤连蛋白包被的24孔板，在恒温培养箱中培养4天；洗去未贴壁细胞，加入培养液再次培养至第7天。取上述消化后的细胞悬液，加入终浓度为10μg/mL 的Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I，随后置于37℃恒温孵育1h，4%多聚甲醛室温固定30min，荧光显微镜下选取Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双染的细胞，即为EPCs，计算双染阳性率。
1.3 实验分组及干预
　　本研究成功分离培养出EPCs，荧光显微镜下Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双染阳性率大于90.00%。将所得到的EPCs接种至无血清培养基中，恒温培养箱中孵育24h；后将细胞浓度调整为1×107/mL的细胞悬液备用。取上述细胞悬液，按照随机数字表法随机分为对照组和DHT组。对照组不进行任何处理；DHT组EPCs细胞接受10 nmol/L的DHT干预。所有细胞均置于恒温培养箱中孵育24h。
1.4 Transwell小室检测EPCs的迁移能力
　　通过Transwell小室评估EPCs的迁移能力。取100μL上述细胞悬液接入Transwell小室，同时在下室加入100μL的培养基；恒温培养箱中孵育过夜；取出小室，去除上层为移动的细胞，4%多聚甲醛室温固定后苏木精染色，荧光显微镜下（×200倍）计数迁移至下层的细胞数目。
1.5 Western bloting检测EPCs中的信号蛋白的浓度
　　取上述细胞悬液在1500r/min室温离心10min，弃上清，得EPCs，加400μL的RIPA细胞裂解液，置于冰上裂解1h。随后在3000r/min、低温（4℃）离心10min，取上清，得细胞总蛋白，采用Barfford法测量其该蛋白浓度；随后加入上样缓冲液，100℃煮沸5min，-20℃低温保存备用。在Western bloting仪器中电泳，转膜，室温条件下封闭2h，洗涤后加入相应的单克隆抗体，4℃过夜。洗涤后加入鼠抗兔IgG-HRP的二抗，室温孵育2h。ECL法曝光，测量蛋白条带的灰度值。
1.6 免疫共沉淀法检测EPCs中的信号蛋白的磷酸化水平
　　取200 μL的上述细胞裂解物，加入相应的单克隆抗体，低温（4℃）摇床（5r/min）上孵育过夜。加入蛋白A或G琼脂糖微球（10μl-30μl的50%微球浆）。低温（4℃）摇床（5r/min）孵育1h~3h；3000r/min、低温（4℃）离心30s；弃取上清，得沉淀，500 μL细胞裂解液洗5次。取沉淀加入相应的磷酸化单克隆抗体进行Western免疫印迹分析。
1.7 统计学分析
　　所有数据均采用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析，计量资料用x±s表示，数据间均数比较采用独立样本t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 DHT促进EPCs的迁移能力的机制
　　对Transwell小室迁移实验的结果进行统计分析，结果如图1A所示：与对照组（58.20 ± 9.48个）相比，DHT干预后能够显著增加迁移至下层的DPCs计数（110.40 ± 9.58个），差异具有统计学意义（t=-8.664，P=0.000）。
　　对EPCs内RhoA表达量进行统计分析，结果如图1B所示：与对照组（0.43 ± 0.07）相比，DHT干预后能够显著增加EPCs内RhoA磷酸化水平（0.93 ± 0.13），差异具有统计学意义（t=-7.489，P=0.000）。
　　对EPCs内ROCK磷酸化水平进行统计分析，结果如图1C所示：与对照组（0.35 ± 0.07）相比，DHT干预后能够显著增加EPCs内ROCK磷酸化水平（1.05 ± 0.12），差异具有统计学意义（t=-10.907，P=0.000）。
　　对EPCs内JNK蛋白磷酸化水平进行统计分析，结果如图1D所示：与对照组（0.53 ± 0.16）相比，DHT干预后能够显著增加EPCs内JNK蛋白的磷酸化水平（0.91 ± 0.08），差异具有统计学意义（t=-4.643，P=0.002）。

3.讨论
　　EPCs起源于胚外中胚层卵黄囊血岛，主要存在于新生儿脐带血和骨髓中，具有强大的增殖、修复潜能。成年人的EPCs主要位于骨髓中，在各种生理和病理刺激下，骨髓EPCs迁移至外周血液中，随着循环到达损伤部位，促进血管内皮修复和新生血管形成[1]。临床研究证实，冠心病患者EPCs的数量、迁移和增殖能力下降，且外周血中EPCs数量与心血管疾病发生率以及心血管不良事件的发生率呈显著负相关[3]。
　　雄激素主要是由睾丸利用胆固醇合成的一类类固醇激素，近年来大量临床研究发现，血清睾酮水平与男性患者动脉粥样硬化及冠心病的发病率呈现负性相关，在雄激素分泌不足所致的性功能障碍的男性患者的外周血中的EPCs计数显著低于正常男性；给予雄激素替代治疗后，EPCs计数显著上升[4]。
　　RhoA是一种小分子单体G蛋白分子，活化后的RhoA通过激活其下游蛋白分子ROCK而发挥生物学作用。ROCK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，活化后ROCK蛋白能够刺激肌球蛋白与肌动蛋白的交互作用，参与调控多种细胞的迁移。MAPK是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，是RhoA/ROCK通路的重要下游分子，研究较为广泛的MAPK信号通路主要为JNK信号通路、ER1/2通路等。
　　本研究采用10 nmol/L的DHT对人EPCs进行体外干预，并利用Transwell小室评估EPCs的迁移功能，结果亦发现DHT能够显著增加EPCs的迁移能力；同时本研究亦发现DHT能够显著增加RhoA、ROCK和JNK蛋白分子的磷酸化水平。
　　综上所述，本研究发现DHT能够增强EPCs的迁移能力，其机制主要涉及RhoA/ROCK信号通路介导的JNK蛋白磷酸化。
　　
参考文献
[1] Peters, E.B., Endothelial Progenitor Cells for the Vascularization of Engineered Tissues.[J] Tissue Eng Part B Rev, 2018, 24(1): p. 1-24.
[2] 李曦哲, 杨., 叶一舟, 雄激素通过上调血管内皮生长因子表达调控内皮祖细胞的功能.[J] 中华实验外科杂志, 2016, 33(2): p. 432-435.
[3] Balbarini, A., M.C. Barsotti, R. Di Stefano, et al., Circulating endothelial progenitor cells characterization, function and relationship with cardiovascular risk factors.[J] Curr Pharm Des, 2007, 13(16): p. 1699-713.
[4] Foresta, C., A. Di Mambro, N. Caretta, et al., Effect of vardenafil on endothelial progenitor cells in hypogonadotrophic hypogonadal patients: role of testosterone treatment.[J] Clin Endocrinol (Oxf), 2009, 71(3): p. 412-6.